2017 Fiscal Year Research-status Report
Function of NANOG as an inhibition for free c-MYC-dependent apoptosis
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17K15604
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
平崎 正孝 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (10522154)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ES細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
安全な再生医療の実現には、ES細胞およびiPS 細胞が共通に有する分化多能性・自己増殖性という特筆すべき性質を、分子レベルで正確に理解することは極めて重要であると考える。私が所属する研究室では、以前にMYCのパートナー因子であるMaxを欠失させたES細胞がアポトーシスを示し、この表現型はNanogの強制発現によって抑圧される事を報告した。しかしながら、Maxを欠失させたES細胞がアポトーシスを示すメカニズムは全く解明されていなかった。そこで、私がMaxホモ欠失ES細胞が呈するアポトーシスの原因を探ることを目的に研究を進めてきた結果、MAX非結合型c-MYCがアポトーシスを誘導し、NANOG は、遊離c-MYCと結合する事で、アポトーシス誘導に対する抑制因子として機能している可能性が示唆された。
そこで、本申請では、(1)Max欠失ES細胞におけるアポトーシス誘導因子としての遊離c-MYC の機能解明と、(2)Maxホモ欠失ES細胞が呈する致死的な表現型を消失させる上でのNANOGの分子機能の解明という2つの研究項目を中心に研究を遂行している。
初年度は、アポトーシス誘導因子としての遊離c-MYCの機能解明の為に次の２つの実験計画を立案施工した。
1 Max/c-Myc/N-Myc遺伝子三重破壊ES細胞の作成と表現型解析 Max欠失ES細胞におけるMYCの機能を明らかにする為に、Max/c-Myc/N-Myc遺伝子トリフルホモ欠失ES細胞を作製するし表現型解析（特にアポトーシス）を行った。
2 ChIPシーケンスによるMAX非結合型c-MYCタンパク質のゲノムへの結合部位についての網羅的な解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Max/c-Myc/N-Myc遺伝子三重破壊ES細胞を、以下のように3段階に分けて作成した。(1)Max欠失ES細胞のc-MycをCRISPR-Cas9システムによって破壊する。(2)Max/c-Myc 遺伝子ダブル欠失ES細胞にc-MYC-ER融合タンパク質を発現するプラスミドべクターを導入し、安定発現株を得る。(3)4-OHTの添加により、外来性のc-Mycの発現を確保しつつN-Myc遺伝子をホモ欠失した。
TUNELやCaspase-3などを指標に、Max単独破壊と比較して、三重破壊時でアポトーシスのレべルを調べたが、予想に反して、c-Myc/N-Myc欠損によるアポトーシスの緩和は見られなかった。Max/c-Myc/N-Myc 遺伝子三重破壊ES細胞は、Doxを添加と4-OHT の除去によって条件的に欠損となるが、Dox添加と、4-OHTの除去ではMaxとc-Mycが欠損するタイミングが同調しなかった事が原因の一つとして考えられる。
c-Mycのchipは、Santa Cruz社のsc-764抗体を使用し、Chip部分は、ニッポンジーン社のOneDay Chip Kitを使用した。IgGのサンプルと比較して、c-Mycの既知の結合箇所に結合が確認できた。
このサンプルを用い、illumina社のHiSeq2500でChip-Seqを行った。その結果、Max存在下で過去に報告されていた箇所にピークは見られず、テロメアなどのリピート配列が大量にデータとして抽出された。この事は、Chip部分で使用した、ニッポンジーン社のOneDay Chip Kitが、アガロースビーズを用いている為、不特定の染色体断片(特にリピート配列であるテロメア部位)を濃縮させてしまった可能性が考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
Max単独破壊と比較して、三重破壊時にアポトーシスのレべルを調べたが、予想に反して、c-Myc/N-Myc欠損によるアポトーシスの緩和は見られなかった。そこで、sh-RNAによってc-Mycの遺伝子発現を減少させたMax欠失ES細胞を作成し、アポトーシスについての解析を行っ結果、アポトーシスの緩和が見られた。今後は、この細胞を用い、DNA マイクロアレ イ解析を行う。
c-MycのChip-Seqを行ったが、テロメアなどのリピート配列が大量にデータとして抽出された。この事は、Chip部分で使用した、アガロースビーズが原因の一つとして考えた。そこで、Chipを磁気ビーズで行い、また、抗体とのaffinityを上げる為に、c-MycにMyc-tagを融合した融合タンパク質で、chip-seqを行う事とする。
Max 欠失 ES 細胞が呈する致死的な表現型はNanogの強制発現によって回避されるが、新たにNANOGがMAX非依存的にc-MYCと結合することを見出した。この結果から、c-MYC の結合個所は、Nanogの強制発現によって変化しており、その事がアポトーシスの回避に関係していると考えた。そこで、ChIPシークエンス解析により、Nanog強制発現Max欠失ES細胞でのc-MYCのゲノムでの結合部位を明らかにする。
NANOGは、NuRD複合体の機能を活性化する機能をもち、NuRDの構成因子であるMBD3はc-MYCと結合することかが報告されている。新たに、Max 欠失ES細胞かが呈する致死的な表現型は Mbd3の強制発現によって回避される事を見出した。そこで、Mbd3強制発現Max欠失ES細胞に対してDNAマイクロアレイ解析を行い、強制発現されたMBD3がどの様な遺伝子群の発現に関与しているかを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
Max/c-Myc/N-Myc遺伝子三重破壊ES細胞の作成と表現型解析 Max欠失ES細胞におけるMYCの機能を明らかにする為に、Max/c-Myc/N-Myc遺伝子トリフルホモ欠失ES細胞を作製するし表現型解析（特にアポトーシス）を行った。TUNELやCaspase-3などを指標に、Max単独破壊と比較して、三重破壊時にアポトーシスのレべル調べたが、予想に反して、c-Myc/N-Myc欠損によるアポトーシスの緩和は見られなかった。本来は、Max/c-Myc/N-Myc遺伝子三重破壊ES細胞においてDNAマイクロアレイ解析を行う計画であったが、アポトーシスの抑圧が見られなかった為、控えた。
しかし、ノックアウトではなく、ノックダウンの系で実験をやり直したとこと、期待通りの結果が得れている為、2018年度で差額が生じた予算を使用して、DNAマイクロアレイ解析を行う予定である。
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Research Products
(3 results)
