2017 Fiscal Year Research-status Report
Histological and functional analysis of phosphodesmin-deficient mice
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17K15615
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
山川 大史 三重大学, 医学系研究科, 助教 (20631097)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 中間径フィラメント / Desmin / 細胞分裂 / 早老症 / 筋肉 / 心筋 / 骨格筋 / 平滑筋 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでに筋肉組織に特異的な中間径フィラメントであるDesminのリン酸化不全が、細胞分裂障害を誘導することを培養細胞レベルの実験で明らかにしてきた。本研究では、Desminのリン酸化不全マウス（DesminSA/SAマウス）を新規に作製し、筋肉組織（心筋・骨格筋・平滑筋）の細胞分裂障害の有無、またそれに伴う機能障害を調べることで、Desminリン酸化の生理的意義を明らかにすることを目的としている。
初年度はノックインマウスの作製と表現型の解析を実施した。
DesminSA/SAマウスは雌雄ともに体重の減少がみられ、心臓や骨格筋の線維化が若年期から出現するという筋組織特異的な表現型が明らかとなった。これは我々が以前、間葉系組織に特異的な中間径フィラメントであるVimentinのリン酸化不全マウスにおいて、Vimentinの高発現部位の細胞分裂障害が若年期の白内障の発症や創傷治癒の遅延といった早老症をきたすという知見とも合致する。
また、外観や筋組織以外の組織解析から、DesminSA/SAマウスは脊椎湾曲や平滑筋の異常と思われる腎臓血管の拡張といった現象も見られることを明らかにした。
以上より、初年度は表現型解析が順調に進めることができた。一方で、これらの表現型の一部は既に報告されているDesmin欠損マウスの表現型と類似しているため、Desminの欠損とリン酸化不全間における病態が確立されるまでの過程の相違点を明らかにすることも課題の一つとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
始めに筋組織に特異的に発現している中間径フィラメントを調べるために、培養筋細胞において発現が確認されているDesminとVimentinについて、マウス組織の発現分布を蛍光免疫染色にて確認した。培養細胞レベルで発現していたVimentinは、生体内では、血管周囲の平滑筋には発現が認められたが心筋や骨格筋はDesminのみ発現していることを明らかにした。心筋、骨格筋の解析にはDesminSA/SAマウスを用いた。一方で、平滑筋の解析を行うため、当初の予定を繰り上げてDesminSA/SAとVimentinSA/SAの交配に着手した。
心筋、骨格筋において、Desminリン酸化の強い時期を特定するために、抗リン酸化Desmin抗体を用いて、胎児期から成体を経時的にDesminのリン酸化の生じる時期の詳細を調べた。心筋では胎児期によくリン酸化しており、出生後減少していく傾向があった。一方で、骨格筋は出生後ほとんど検出されないことから骨格筋の細胞分裂は胎児期にほとんど終了するものと推測された。
DesminSA/SAマウスの外観の解析から、野生型マウスに比べて、体格が小さいこと、体重減少を明らかにした。また組織解析から、心臓と骨格筋の線維化が亢進していることを明らかにした。また、平滑筋によって裏打ちされている血管の観察を行う中で、腎臓の血管が拡張する可能性を見出した。また、ある時期から脊椎湾曲が見られるようになることから、骨の異常あるいは骨を支える筋肉の異常が示唆された。
心臓や骨格筋の線維化はDesmin欠損マウスの表現型と類似していることから、Desminの発現量に着目した。興味深いことに、心筋、骨格筋ともにDesminの発現が減少していることを明らかにした。以上より、DesminSA/SAマウスにおける心臓や骨格筋の線維化の原因の一つにDesmin発現の減少が考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
DesminSA/SAマウスにおける心臓や骨格筋の線維化の原因の一つとしてDesminの発現量低下が考えられた。そのため、Desminの発現低下がいつ生じるかを確認する必要がある。Desminのリン酸化が強い胎児期を中心にDesminの免疫染色による組織学的な解析を行う。
一方でDesminSA/SAマウスには薬剤耐性遺伝子ネオマイシンもDesmin遺伝子と並列して挿入している。これがアーチファクトとなり、Desminの発現を消失させていることも考えられる。CAG-CreマウスとDesminSA/SAマウスの交配により、flox間のネオマイシン遺伝子を消失させ、DesminSA/SA・Neo-マウスを作製する。これによりDesminSA/SAマウスのDesmin発現が回復すれば、Desmin発現量の低下はアーチファクトとなる。そのため、DesminSA/SA・Neo-マウスで表現型解析を再開する。当研究室では既にCAG-Creマウスを飼育しており、DesminSA/SAマウスとの交配を進めている。心筋は主に胎児期と出生後2週間ほどまで細胞分裂が見られるため、胎生致死となる可能性も視野に入れ、解析を進める。まずは出生マウスにDesminSA/SA・Neo-マウスが存在するかで確認する。生育可能であれば、成体の表現型解析を、生育不可であれば、胎児期の心筋、骨格筋の発生段階の組織学的な解析を進める。
また、マウス胎児や新生児から心筋細胞を分離し、生体由来細胞でDesminリン酸化の細胞分裂における役割の有無を調べる。
一方で、既存のDesminSA/SAマウスの平滑筋にはDesminの発現が認められたことから、腎臓血管の拡張の再現性を取るとともに、平滑筋細胞の分裂障害や形態異常、機能異常について解析を進める。
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Research Products
(3 results)
