2017 Fiscal Year Research-status Report
Novel mechanism of post-transcriptional regulation of PD-L1 through 3'-UTR.
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17K15616
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| Research Institution | National Cancer Center Japan |
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Principal Investigator |
木暮 泰寛 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 研究員 (40782389)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | PD-L1 / 3'-UTR / 転写後調節 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腫瘍細胞は、免疫チェックポイント分子であるPD-L1を発現することにより活性化T細胞を抑制し免疫を回避する。様々な腫瘍において、PD-L1 3'-UTRの短縮・喪失する例が見出され、それらの異常によりPD-L1 mRNAの安定性が高まりタンパク発現も亢進することが明らかになった。同機序によりin vivoでの免疫回避が生じることも明らかになり、これが腫瘍の増殖にとって重要であることが示された（Kataoka et al. Nature 2016）。RNA 結合タンパク（RBP）による転写後調節に着目してPD-L1高発現の機序を明らかにするため、まずPD-L1 3'-UTRのどの部位が転写後調節に重要であるかという点について、（１）レポーターアッセイ（２）CRISPR/Cas9 saturation mutagenesisライブラリーの2つを用いて検討した。
（１）について、様々なdeletion mutatntを用いて、500 bp程度の範囲で転写ご制御に重要な部位を決定した。（２）については、PD-L1 3'-UTRをコードするゲノム領域を網羅的に欠損させる手法（Canver et al. Nature 2015）を取り入れた。しかし単一のgRNAが細胞に導入できる数塩基規模のdeletionによる発現変化は、3'-UTR全体の欠失によるPD-L1発現量亢進に比べて小さいことが分かった。そのためライブラリの効果を精密に検出するのが困難であり、この系での評価は難しかった。そこで、（１）の結果を採用して次のステップに進むことにした。RNA結合分子をmass spectrometryで網羅的に解析するiSRIM法を実施し、mRNAとRBPの結合を直接的かつunbiasedに評価した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）PD-L1 3'-UTR領域のdeletion mutantを用いたレポーターアッセイでは、PD-L1の転写後調節に重要である領域を500bp程度の範囲まで絞り込むことができた。この長さの領域まで絞り込むことで、次ステップであるiSRIM法によるスクリーニングが効率的に行えるようになった。
（２）については、PD-L1 3'-UTR領域の数bp単位の欠失によるPD-L1発現変化（想定していた効果）に比して、数百から数千bp単位の構造異常による発現亢進（検出系にとってのノイズ）が大きかった。この想定外の結果により、本検出系でのPD-L1 3'-UTRの機能詳細は難しいと考えた。
しかしながら、（１）レポーターアッセイによる絞り込みの結果を用いることで、iSRIM法を実施し、その結果を解釈をすることは十分に可能であると考えられ、計画に大きな遅滞を生じなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）レポーターアッセイとiSRIM法を組み合わせ、PD-L1の発現と相関する3'-UTR segmentと相関しないsegment、そしてそれぞれのsegmentに結合するタンパクの一覧が完成した。そこでこれらのsegment同士を比較することによって、考慮するべきタンパク質、すなわち候補RNA binding proteins (RBPs)を絞り込む。その後、これらのタンパクのPD-L1発現量に対する寄与を評価する。具体的には、siRNAやCRISPR/Cas9を用いたRBPのノックダウン・ノックアウトを行い、PD-L1の発現量上昇を観察する。それらの系でタンパクが機能的に絞り込めたら、3’-UTRのタンパク結合ドメインへ変異を導入する系などを用い、より多角的に候補RBPの機能を評価していくことを予定している。
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[Presentation] Novel mechanism of post-transcriptional regulation of PD-L1 expression by 3’-UTR binding proteins. / 3´-UTR結合タンパクによるPD-L1発現の転写後調節機構の解明2017
Author(s)
Yasunori Kogure, Keisuke Kataoka, Shungo Adachi, Yosaku Watatani, Ayana Kon, Kenichi Yoshida, Masahiro Nakagawa, Tomohisa Hatta, Tohru Natsume, Seishi Ogawa,
Organizer
第79回日本血液学会学術集会
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