2017 Fiscal Year Research-status Report
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17K15623
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
波田 一誠 大分大学, 医学部, 助教 (00546202)
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2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 断片化tRNA (tRF) / CLP1 / 橋小脳低形成 / 神経変性疾患 / ヒト神経芽細胞株 / ゼブラフィッシュ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、 橋小脳低形成10型 CLP1 遺伝子変異による断片化した tRNA (tRF) の蓄積が神経変性疾患の原因であるのかをヒト神経芽細胞株とゼブラフィッシュを用いて検証した。
申請者は、tRNA 前駆体由来 5’ エキソン断片、3’ エキソン断片、あるいは tRNA 前駆体由来イントロン断片などの様々な tRF をそれぞれトランスフェクションしたヒト神経芽細胞株を観察したが、細胞数や形態に異常は見られなかった。しかしながら、分化誘導を行った際に、ある tRF （xtRF） をトランスフェクションした細胞株においてのみ、細胞数の減少が認められた。分化誘導を行った xtRF トランスフェクション細胞株において、p53 タンパク質の活性化（リン酸化）がみられたので、 p53欠損ヒト神経芽細胞株を樹立し、同様の実験を行った。その結果、分化誘導を行った xtRF トランスフェクションp53欠損細胞株において、細胞数の減少は認められなかった。
一方、xtRF を受精卵にインジェクションしたゼブラフィッシュでは、神経発生が異常となり、頭部の縮小及び尾部の湾曲が認められた。また、TUNEL 法を用いた組織学的解析によって、 xtRF がゼブラフィッシュの神経細胞のアポトーシスを引き起こすことを明らかにした。ゼブラフィッシュにおける xtRF に対するこのような生体反応は、p53 のモルフォリノを用いたノックダウンによってレスキューされた。
以上より、 CLP1 遺伝子変異による神経変性は xtRF の蓄積による p53 の活性化によって引き起こされていることが明らかとなった。これらの成果は、RNA キナーゼ CLP1 遺伝子変異の病態メカニズムの一旦を解明しただけでなく、機能性 RNA による新規細胞ストレス応答機構を明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成29年度の計画は、「どのようなtRNA断片 (tRF) が細胞ストレスを惹起するのか？」を in vitro と in vivo において明らかにすることであった。【研究実績の概要】に示してあるように、申請者はヒト神経芽細胞株を用いた解析によって、ある tRF （xtRF）のみが、分化誘導後にp53の活性化及び細胞数の減少を示すことを明らかにした。さらに、この細胞数の減少は、p53欠損細胞株においてレスキューされた。さらに申請者は、ゼブラフィッシュを用いた解析によって、xtRFが神経発生の異常及び尾部の湾曲を引き起こすことを示した。ここまでで、当初の計画をすべて遂行したことになる。
申請者は、in vivo において、さらなる解析を行い、xtRFが神経特異的にアポトーシスを起こすこと、モルフォリノによってp53の機能を低下させたゼブラフィッシュでは xtRF による尾部の湾曲が回復することを明らかにした。
申請者は、当初の計画よりさらに踏み込んだ解析を行い、in vivo における xtRF の役割をより詳細に明らかにすることができた。従って、本研究の進捗状況における区分を (1) 当初の計画以上に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の展開について申請者は、tRF がどのような因子を介して p53 を活性化するのかを明らかにしていく。
tRF と相互作用するタンパク質を同定するために、申請者は、プロテアーゼプロテクションアッセイを利用する。具体的には、ヒト神経芽細胞株の粗抽出液に tRF を混合し、プロテアーゼで処理した後に、tRF にプロテクトされて消化されずに残ったタンパク質断片を解析する。現在、予備実験において申請者は、 tRF を混合した神経芽細胞株抽出液を用いて、プロテアーゼで消化されないタンパク質断片を検出している。このようにして得られたバンドを質量分析計で解析し、tRF 結合タンパク質を同定する。候補タンパク質が実際に tRF と相互作用するのかについては、 EMSA （ゲルシフトアッセイ）を用いて確認する。同定されたタンパク質が tRF の蓄積と神経発生異常との間を介するのかを検証するために、CRISPR/Cas9 システムによって作製した同定タンパク質遺伝子欠損神経芽細胞株に tRF をトランスフェクションし、分化後にアポトーシスが起きないことを確認する。また、 CRISPR/Cas9 システムによって作製した同定遺伝子欠損ゼブラフィッシュに tRF をトランスフェクションし、この変異体においても神経変性が起こらないことを確認する。
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