遺伝子発現制御にかかわる新規RNAの作用機序の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K15671
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 原田 裕一郎 東京医科大学, 医学部, 助手 (80570168)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: RNA干渉 / miRNA

Outline of Annual Research Achievements

これまで、がん治療のために様々な治療法が生み出されてきた。近年、がん治療において注目を集め盛んに研究が進められているのが、がん細胞特有の分子に焦点をあてた分子標的治療薬の開発である。私は分子標的薬であるmiRNAに着目し、新たな構造を持つ短縮型miRNA（ghRNA）を開発に携わってきた。このghRNAは高いがん遺伝子抑制を示し、副作用も少ないと考えられる。しかし、このghRNAはこれまでのmiRNAとは大きく構造が違うことから、これまで考えられているmiRNAの作用機序とは異なる可能性がある。そこで、本研究では短縮型miRNA（ghRNA）による遺伝子発現の抑制機序を解明することを目的としている。
短縮型miRNA(ghRNA)の機能や作用機序を解析するため、まずは細胞内での内在性ghRNAの探索をおこなった。その結果、がん細胞内で転写されたRNAの網羅的解析からsmall-RNAに相当すると思われる長さのRNAを選別し、さらにその配列情報を基に二次元構造予測から本研究の対象とするghRNAになりうるRNA配列を細胞内に多数見出した。今後この解析で見出したghRNAが標的とする遺伝子を予測検討する。
さらに、miRNAによる遺伝子発現抑制は二つのRNse活性を持つタンパク質、DicerとAgoファミリータンパク質（Ago1~4）が重要であることがわかっている。そこで、Dicer-Agoによる遺伝子制御とghRNAの関連を調べるために、DicerおよびAgoファミリータンパク質を欠損した細胞株の作製を進めている。方法としてCRISPR/Cas9を用いてDICER欠損細胞株を作製中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成29年度に予定していた研究は概ね終了もしくは進行中であるため

Strategy for Future Research Activity

今年度は昨年度に見出した内在性ghRNAの細胞内での機能の一端を検証する。先の網羅的解析結果から見出した内在性のghRNAとその標的予測によって得られた遺伝子候補を用いて内在性ghRNAの遺伝子抑制機能について検討をおこなう。この実験では細胞増殖および細胞周期などから、がんや疾病に関わる遺伝子およびghRNAを優先的におこなう。機能解析としては、まずは見出した新規ghRNAを細胞に導入し、その後細胞より全RNAを抽出し、導入した新規ghRNAが標的すると予測された遺伝子の発現量の変化を検討する（qPCR）。それによって、実際に発現量の変化する遺伝子を見出し、新規短縮型miRNAと標的遺伝子の制御関係を明らかにする。また、新規短縮型miRNAが標的とする遺伝子が多岐に渡る場合にはマイクロアレイ解析をおこなうことで新規短縮型miRNAが作用する遺伝子群の全体像を明らかにすることができる。
さらに、前年度に引き続き、RNA干渉に不可欠と言われる分子のAgoファミリーの欠損細胞株の作製をおこなっていく。そして、DicerおよびAgoファミリータンパク質の欠失した細胞株を作製することでghRNAの作用機序に必須な分子の一端を明らかにできると考えられる。

Causes of Carryover

参加を予定していた国内研究会（日本RNAi研究会）に参加できなかったため、次年度使用額が発生してしまいました。
翌年度は多くのqPCRおよびマイクロアレイをおこなうことが予想されるため、次年度使用額をそれらの研究に充当する予定です。