遺伝子発現制御にかかわる新規RNAの作用機序の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K15671
• Research Institution: Tokyo Medical University
• Principal Investigator: 原田 裕一郎 東京医科大学, 医学部, 助手 (80570168)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: RNA干渉 / miRNA

Outline of Annual Research Achievements

元来、細胞内にはRNA干渉と呼ばれる特異的にターゲットとするメッセンジャーRNA（mRNA）を分解する機構が存在する。この機構においてターゲットとするmRNAを識別する分子としてmiRNA（マイクロRNA）が重要な働きをしている。しかし、私はこれまでに本来のmiRNAとは異なる構造のmiRNA（短縮型miRNA、ghRNA）がRNA干渉を引き起こし、ターゲットとなる遺伝子の発現を抑制することを見出している。また、細胞内に存在する全てのRNAの解析から内在性のghRNAが存在することが示唆されている。そこで本研究ではその短縮型miRNAの探索とその作用機序の解明を目的として研究を進めている。
本年度の研究では、前年度に引き続き短縮型miRNA（ghRNA）の探索をおこなった。その結果、複数のghRNAと思われる低分子のRNAを見出すことができている。それらghRNAがターゲットとする遺伝子を予測したところ、少数ではあるが今回見出したghRNAのうちのいくつかはがんや増殖、細胞分裂などに関連すると思われる有用な遺伝子をターゲットとしていることが示された。そこで、このghRNAを用いてターゲットとなる遺伝子のRNA干渉が誘導されるかどうか検討を続けている。
されに、ghRNAのによるRNA干渉機構を解析するためにRNA干渉に関わるDicer1およびAGOファミリータンパク質を欠損した細胞株の作製を進めている。今年度はDicer1欠損細胞株が完成した。この細胞株を用いた実験では、現在のところ内在性のghRNAはDicer1を欠失していてもターゲット遺伝子の発現を抑制しているようである。このことは内在性ghRNAがDicer1とは独立して機能している可能性が示唆されている。またAGOファミリータンパク質についても欠損細胞株の作製を続けている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Dicer1とAGOファミリータンパク質の欠損細胞の作製に予想以上の時間がかかっており、そのため、これらの細胞株を用いた実験が多少おくれが出ることが予想されている。それ以外の部分においては概ね予定通りに進行している。

Strategy for Future Research Activity

Dicer1およびAGOファミリータンパク質欠損細胞株の作製に時間はかかっているが、今後の実験にとって肝要な部分であるため時間的スピードを意識しつつ確実な研究を進めていく。
Dicer1とAGOファミリータンパク質の複数欠損細胞を用いてghRNAとDicer-Agoによる遺伝子発現抑制の作用機序を解析する。ghRNAをDicer-Ago欠損または非欠損細胞に導入し、標的遺伝子の発現量をqPCRおよびマイクロアレイによって解析する。
さらに、ghRNAによるRNA干渉にかかわる分子としてDicer1およびAGO以外に関与することが考えられることから、ghRNAをリガンドとして用いたアフィニティ精製により細胞抽出物からghRNAによるRNA干渉関連分子の取得を試みる。

Causes of Carryover

消耗品等の消費が少なかったことおよび前年度からの在庫などを使用により次年度使用額が発生しました。
次年度は多くの細胞培養および遺伝子解析およびタンパク質精製とその解析を予定している。