2017 Fiscal Year Research-status Report

志賀毒素に対するB鎖標的型組換えトキソイドワクチンの分子構築

Research Project

Project/Area Number	17K15687
Research Institution	University of the Ryukyus
Principal Investigator	玉城志博琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 助教 (00720822)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2019-03-31
Keywords	志賀毒素 / EHEC / トキソイドワクチン / 分子デザイン
Outline of Annual Research Achievements	本研究課題ではAB5型毒素の一つである志賀毒素（Shiga toxin, Stx）に対するヒト用トキソイドワクチンを構築する。Stxの１型（Stx1）および２型（Stx2）のB鎖（Stx1BおよびStx2B）を連結させることにより、一つのタンパク質性抗原でStx1およびStx2両方の毒素に対応できるトキソイドワクチンを開発する。連結型ワクチン抗原（Stx1B-Stx2BおよびStx2B-Stx1B）をGb3-ELISAでその性状（生化学的）解析を実施した。まず、１ウェルあたりの添加タンパク質を統一してアプライし、連結部分に挿入してあるHis-tagを用いて検出したところ、Stx1B-Stx2Bの方がより高い吸光度を示し、Stx2B-Stx1Bと比較してGb3に対してより親和性が高いことが示された。次に、この結果を基にGb3に結合するタンパク質量を統一し、抗Stx1または抗Stx2マウス抗血清で検出したところ、両マウス抗血清に対してStx2B-Stx1Bの方がより高い吸光度を示し、その２種のB鎖構造はより天然型のB鎖に近い分子構造を取っていることが示唆された。また、平成３０年度に計画していた「３．StxB鎖連結型トキソイドワクチンの連結順番によるワクチン機能解析」を今年度前倒しで実施した。StxBのN末端側にコイルドコイルタンパク質COMPを融合させたコンストラクト（COMP-Stx1BおよびCOMP-Stx2B）を作製し、これまでと同様に大腸菌で発現させた。これらCOMP融合タンパク質でマウスを免疫後、志賀毒素（Stx1およびStx2）でそれぞれ腹腔内攻撃したところ、COMP-Stx2BではCOMPをC末端に融合させたStx2B-COMPより生存率が低下した。このことから、Stx2Bにタンパク質を融合させる場合、C末端側に融合させる方が安定であることが示された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 1: Research has progressed more than it was originally planned. Reason これまでにStx1B-Stx2BおよびStx2B-Stx1Bでマウスを免疫し、その後、志賀毒素（Stx1およびStx2）で腹腔内攻撃すると、両連結型ワクチン抗原ともワクチン機能が確認されたが、Stx1B-Stx2Bと比較して、Stx2B-Stx1Bの生存率はより高い値を示し、ワクチン機能に差があることが分かっている。そこで平成２９年度はStx1B-Stx2BおよびStx2B-Stx1Bの詳細な性状解析（Gb3-ELISA）を実施し、Stx2B-Stx1Bの方が両方のB鎖構造がより天然型のB鎖に近い立体構造を取っていること示した。また、平成３０年度に計画していた「３．StxB鎖連結型トキソイドワクチンの連結順番によるワクチン機能解析」を前倒しで実施し、Stx2Bにタンパク質を融合させる際には、N末端側ではなく、C末端側に融合させる方がより安定であることを示した。以上の結果から、Stx2B-Stx1Bの方がStx1B-Stx2Bよりワクチン機能が優れている主な要因が分かった。
Strategy for Future Research Activity	平成３０年度はStx1B-Stx2BおよびStx2B-Stx1Bの連結順番によるワクチン機能に差があることを再度確かめ、StxB連結型トキソイドワクチン開発において、抗原産生技術が本質的に異なる可能性を確認する。また、Stx1およびStx2両毒素で同時に攻撃した場合の毒素中和能についても検討する。さらに、これらの連結型ワクチン抗原で誘導した抗血清を用いて、受動免疫方でも両毒素を耐過することが可能か検証し、Vero細胞を用いた中和試験でも抗血清の中和機能を検証する。それまでに得られた知見に基づき、同じAB5型毒素のコレラ毒素（CT）または易熱性毒素（LT）のB鎖（CTBまたはLTB）と連結し、多重化させたトキソイドワクチンの試作を試みる。その際にも連結する順番を重要な要因として検証する。