2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K15693
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| Research Institution | Matsuyama University |
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Principal Investigator |
関谷 洋志 松山大学, 薬学部, 助教 (70454890)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ウェルシュ菌 / 溶菌酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私たちは溶菌酵素Psmの酵素活性に重要なアミノ酸や菌との結合に重要なアミノ酸などを明らかにしてきた。しかし、Psmが菌のどこに結合するのかは明らかになっていない。他の研究グループから、Listeriaのファージ酵素PlyP35の細胞壁結合ドメインは、タイコ酸を除去した細胞壁には結合できないことがこれまでに報告されていた。そこで、細胞壁に存在するタイコ酸がPsmの溶菌活性に与える影響を調べた。ウェルシュ菌にはタイコ酸合成遺伝子として、tagO、tagAなどが存在する。そこで、ウェルシュ菌のゲノム上のタイコ酸合成遺伝子tagO、tagAの上流にキシロース転写制御遺伝子xylRを導入した。RT-PCRの結果、キシロース非存在下の培養したこれらの株はtagO、tagAの発現が大きく抑えられており、細胞壁中のタイコ酸欠乏状態であると推察された。しかし、それらの株を用いて、Psmの溶菌活性に対するタイコ酸の影響を調べたが、Psmの溶菌活性に対するタイコ酸の影響は小さかった。
Psmはウェルシュ菌に強い溶菌活性を示す一方で、菌種特異性が高く同じクロストリジウム属菌に対しても溶菌活性をほとんど示さない。また、Psmは触媒ドメインだけでは溶菌活性を示さないことから、Psmの菌種特異性には菌へのバインディングが重要であると考えられた。Psmの強い溶菌活性を保持したまま任意の菌種にも溶菌活性を示すキメラ酵素を作成するために、Psmの細胞壁結合ドメインとして存在する2つのSH3_3ドメインをディフィシル菌のSH3_3ドメインと組み替えたキメラ酵素を作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
培養したウェルシュ菌から細胞壁を抽出し、フッ化水素処理細胞壁中に含まれているタイコ酸を除去した細胞壁を精製し、順次、保存している。一方、Psmの菌種特異性に関与すると考えられる細胞壁結合ドメイン(SH3_3)を臨床現場において偽膜性大腸炎として問題となっているディフィシル菌の持つ溶菌酵素のSH3_3ドメインと組み替えたキメラ酵素の作製を行ったため、研究の進捗状況に遅れがでてしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
既に、培養したウェルシュ菌から細胞壁を抽出し、フッ化水素処理を行い細胞壁中のタイコ酸を除去したウェルシュ菌の細胞壁を精製し、保存している。2018年度は、Psmの細胞壁結合ドメインを他菌種のものと組み替えたキメラ酵素の作製を優先して研究を行った。2019年度は、精製したウェルシュ菌の細胞壁を解析し、ウェルシュ菌の細胞壁のペプチドグリカンの構造を明らかにし、細胞壁のペプチド鎖の架橋度、グリカン鎖のアセチル化度を調べる。また、GST-SH3_3ドメインを固相化させたカラムを作製し、アフィニティークロマトグラフィーにより、細胞壁の構成成分から溶菌酵素Psmの結合基質を単離し、同定する。
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| Causes of Carryover |
当該年度に使用予定であったが、年度後半に購入した物品が想定より安く納品されたために若干の当該助成金の次年度使用額が生じた。次年度に研究を実施する際に物品費として使用する。
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Research Products
(1 results)
