T細胞におけるTRAF5のS-パルミトイル化機序とその生理的意義の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K15713
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 林 隆也 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 特任講師 (10624851)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 分子間相互作用 / ノックダウン

Outline of Annual Research Achievements

TRAF5とZdhhc15の結合に関して、TRAF5-gp130結合により見出されたTRAF5結合モチーフ（SXXE-X8-EEXXED）の関与を検討した。Zdhhc15内のTRAF5結合モチーフはヒトとマウスで保存されており、どちらも299番目のセリンから始まり316番目のアスパラギン酸で終わるSRSESTQPLLDSEERPEDである。そこで、Zdhhc15のC末端側のTRAF5結合モチーフを欠く末端切断型変異体（1-298番目アミノ酸）発現プラスミドを作製しTRAF5との結合に与える影響を共免疫沈降により検討した結果、野生型Zdhhc15と末端切断型変異体Zdhhc15では同等のTRAF5結合を示した。さらに、TRAF5結合モチーフ後半EEXXEDのグルタミン酸及びアスパラギン酸を全てアラニンに置換したアミノ酸置換変異体Zdhhc15を用いてTRAF5結合能を検討した結果、アミノ酸置換変異体も野生型Zdhhc15と同等のTRAF5結合を示した。以上のことから、TRAF5-Zdhhc15結合はZdhhc15内のTRAF5結合モチーフを介さないことが明らかになった。
次に、正常マウスT細胞におけるZdhhc分子群のmRNA発現レベルの解析により最も発現レベルが高いことが示されたZdhhc18に着目し、T細胞ハイブリドーマを用いてノックダウンの影響を検討した。Zdhhc18を標的とする３種類のショートヘアピンRNA発現ベクターのうち、２種類でZdhhc18 mRNAレベルを半減させることが出来たので、MCC（moth cytochrom c）特異的T細胞ハイブリドーマのZdhhc18をノックダウンしMCCペプチド刺激に対するIL-2産生能の変化をCTLL-2細胞増殖アッセイにて測定したところ、コントロールshRNA処理群と比較してIL-2産生の有意な変化は認められなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成29年度における本研究課題の研究計画では、１：T細胞におけるTRAF5のS-パルミトイル化の検出、２：TRAF5のS-パルミトイル化レベルと細胞内局在の関連性の解析、３：TRAF5のS-パルミトイル化とタンパク質安定性の関連の評価、４：GITRシグナル伝達におけるTRAF5のS-パルミトイル化の役割の解析を予定していた。しかしながら、申請者の研究拠点が国外（ガーナ共和国、ガーナ大学野口記念医学研究所ウイルス部）に移り、実験機器や設備、実験試薬の入手経路、実験材料の運搬の可否等といった研究環境が大きく変化した。そのため、予定していた上記1-4に関しては１、３及び４：マウスの飼育施設が不完全でかつ実験用マウスの入手が極めて困難であるのに加え、マウスT細胞を高純度で効率的に取得する機器が施設内に存在しないなどの理由から遂行困難であった、２：共焦点蛍光顕微鏡および超遠心機が施設内に存在せず遂行困難であった。故に、現在の研究拠点の施設に存在する機器で行える実験で、尚且つ国外に運搬可能な実験試薬・実験材料で遂行できる平成30年度以降の研究計画に関連した一部の実験を行い幾つかの新しい結果を得た。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度以降は、マウスを用いる実験およびT細胞を高純度に精製する実験に関しては現在の研究拠点では遂行することが極めて困難なため日本国内で行う予定である。一方で、T細胞におけるTRAF5のS-パルミトイル化の検出は細胞溶解液を用いて行うことが可能な実験であるので、凍結した細胞溶解液をドライアイスにて運搬しその後の解析を行う予定である。また、TRAF5のS-パルミトイル化レベルと細胞内局在の関連性に関しては、TRAF5変異体発現レトロウイルスベクターをT細胞に感染させ、抗CD3/GITR抗体刺激までは日本国内で行う。当初予定していた共焦点傾向顕微鏡や超遠心を用いた手法は現在の研究拠点では困難であるため、細胞分画キットを用いて形質膜分画内外に存在する野生型および各種TRAF5変異体のレベルを比較する事でS-パルミトイル化による細胞内局在への影響を評価する方針に変更予定である。
TRAF5に対するS-パルミトイル化を担うDHHCファミリーパルミトイルアシル転移酵素群（PATs）の同定においては、HEK293T細胞へのTRAF5及び各種PAT共発現系で評価した場合、TRAF5の導入自体で比較的高レベルのS-パルミトイル化が認められるため相加効果を検出するのが困難である事を示唆する結果を得ている。そのため、タグを付加したTRAF5安定発現HEK293T細胞を用いた系で検討するか、若しくは正常なT細胞とPATsの発現プロファイルが類似しているT細胞ハイブリドーマを用いた各種PATsのノックダウンによるTRAF5のS-パルミトイル化の変化を評価する実験系に変更することを予定している。

Causes of Carryover

研究拠点が国外に移った事により研究に必要となる試薬等の物品に関して、購入後に適切な温度管理の元でそれらを郵送する事が実質的に困難な状況であったため、平成29年度の予算の執行に際してこの問題を解決するまで試薬類の購入を控えざるを得ない状況であった。最終的に、申請者が本邦で購入した試薬等の物品を適宜ドライアイス等を用いて自ら手荷物として国外に輸送する事でこの問題が解決に至る目処がついた。従って、平成30年度以降の予算使用計画は予定を変更せず、平成29年度から繰り越された額に関してはその多くの部分を本邦購入試薬類の輸送に際する旅費等に充てる予定である。