2018 Fiscal Year Research-status Report

RNA修飾であるPoly(A)を活用したミトコンドリア機能検査法の確立と臨床応用

Research Project

Project/Area Number	17K15777
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	相原正宗九州大学, 大学病院, 臨床検査技師 (30748843)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ミトコンドリア / Poly(A)
Outline of Annual Research Achievements	ATP産生能を含めたミトコンドリア機能の低下は老化やパーキンソン病など種々の疾患で報告されている。従って、ミトコンドリア機能の評価は老化や病態の進行、あるいは予後の予測など臨床上有益な情報をもたらすことができると考えている。これまでのミトコンドリア機能評価法は筋肉組織を採取する必要があるため侵襲性が高く現状汎用的な検査法になり得ていない。そこで申請者はATPを基質として伸長されるミトコンドリアmRNAのPoly(A)に着目し、ミトコンドリア機能低下に伴うATPの量的変化とミトコンドリアmRNAにおけるPoly(A)の伸長・短縮との関係性を明らかにし、検査法として応用可能か評価を行っている。一昨年度にミトコンドリアPoly(A)ポリメラーゼのノックダウン並びに過剰発現細胞株を樹立し、Poly(A)の伸長・短縮が細胞内で実際に起こり得ること、また興味深いことにミトコンドリアmRNAの量的変化が同時に起きているることを確認した。昨年度はミトコンドリア機能とPoly（A）の関係性を解析する準備段階として、各ミトコンドリア機能別に標的遺伝子を選別し、標的遺伝子のノックアウトを含めたミトコンドリア機能低下モデル細胞を複数樹立した。また呼吸鎖複合体活性阻害剤を利用したミトコンドリア機能低下の実験条件を確立した。更にハイスループットなミトコンドリアmRNAのPoly(A)測定方法の構築に取り掛かっている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 1.ミトコンドリア機能障害モデル細胞の樹立：ミトコンドリア機能として、ミトコンドリアDNAの複製、ミトコンドリアDNAの転写、ミトコンドリア内翻訳、タンパク質分解、電子伝達系に大別し、それぞれの機能に関与する遺伝子のノックアウト細胞株あるいは一過性ノックダウン細胞株を樹立した。または呼吸鎖複合体活性阻害剤の濃度を増減させることにより多段階のミトコンドリア機能障害細胞の実験条件を確立した。更に、若年あるいは老化マウスからの初代培養細胞株の樹立に着手した。 2.ミトコンドリア機能障害モデル細胞におけるPoly(A)の簡易的測定：ミトコンドリアPoly(A)ポリメラーゼのノックダウンに起因するミトコンドリアmRNAのPoly(A)伸長・短縮が観察可能であった簡易的測定法を用い、ミトコンドリア機能障害モデル細胞におけるPoly(A)の測定を試みたとこと、ミトコンドリアPoly(A)ポリメラーゼのノックダウンに比べ、Poly(A)の伸長・短縮の変化は微弱である可能性が示唆された。またミトコンドリア機能障害モデル細胞ではミトコンドリアmRNAの量的変化も同時にひき起こされており、PCRおよび電気泳動を基本とした簡易的な方法ではモデル細胞ごとの差異を明らかにすることは困難であると判断した。 3.Poly(A)の定量的解析法の確立：Poly(A)の簡易的測定法にくらべ、定量的かつ網羅的にPoly(A)の測定が可能なフラグメント解析並びに次世代シーケンサーを活用した実験条件の検討に着手した。 4.ミトコンドリアRNAの粗精製方法の確立：ミトコンドリアmRNAのPoly(A)をより特異的に定量解析するため、微量検体を想定し少数の細胞からミトコンドリアを迅速に単離する条件においてミトコンドリアmRNAの検出は可能かについて検証を行っている。
Strategy for Future Research Activity	次世代シーケンサーもしくはフラグメント解析を利用したミトコンドリアmRNAのPoly(A)をハイスループットに測定可能な実験条件を構築し、既に確立したミトコンドリア機能障害モデル細胞から精製したミトコンドリアmRNAのPoly(A)を測定することで、ミトコンドリア機能とPoly(A)との関係性を評価する。また実験に用いたミトコンドリア機能低下モデル細胞における細胞内およびミトコンドリア内ATP量を測定することで、ミトコンドリア機能とPoly(A)との因果関係を裏付ける。
Causes of Carryover	当該年度は既存の試薬、細胞株を使用する範疇で実験可能であったこと、また次年度において使用予定の実験試薬等の消耗品あるいは実験機器の購入額が高く、次年度に使用することが望ましいと判断したため。