RGS5遺伝子の甲状腺癌抑制効果解明による新規癌リスク評価検査の開発

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K15779
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 伊藤 祐子 福島県立医科大学, 医学部, 助手 (60402038)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: TTF-1 / RGS4 / RGS5 / RGS16 / 細胞死 / アポトーシス

Outline of Annual Research Achievements

RGS5発現アデノウイルスベクターを作製できなかったため、TTF-1発現が消失したヒト甲状腺癌培養細胞BHP18-21v細胞にTTF-１遺伝子を導入するとともにRGS5遺伝子に対するsiRNAを導入し、TTF-1遺伝子発現下でのRGS5 遺伝子発現を抑制することにより、RGS5遺伝子発現の細胞死誘導への効果を検証することとした。
①TTF-1遺伝子導入によりRGS5遺伝子発現が増加することをreal-time PCR法にて確認した結果、従来の結果と同等の約700倍に増加した。RGS5遺伝子に対するsiRNAを導入し、TTF-1遺伝子導入後にRGS5 遺伝子発現が抑制されることを確認した。RGS5遺伝子発現量はnegative control に比し3%に低下した。
②細胞死誘導におけるRGS5の影響を検討するため、TTF-1遺伝子導入後の生細胞数を吸光測定により測定した。RGS5に対するsiRNA導入の有無により生細胞数を比較した結果、導入有りで増加傾向を認めた。一方、分化度へのRGS5の影響を検討するため、TTF-1遺伝子導入後のサイログロブリン（TG）遺伝子発現量をreal-time PCR法にて確認した。TTF-1遺伝子導入によりTG遺伝子発現量は約14倍に増加したが、RGS5に対するsiRNA遺伝子導入の有無の比較において、現時点では一定の傾向を認めていない。TTF-1遺伝子導入により、RGS5のみならずRGS4、RGS16遺伝子も発現量が増加することが判明したことから、細胞死誘導や分化誘導において、RGS5単独の作用でなく、これらRGS familyとの相補的効果を検討する必要性を認識した。
③TTF-1遺伝子導入による細胞死誘導の機序としてアポトーシスの有無を検討するため、蛍光吸光測定により比較した。TTF-1遺伝子導入により、アポトーシスの増加を認めた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

TTF-1遺伝子導入によりRGS5 遺伝子発現量は約1000倍に増加するが、発現量が著明に増加するのはRGS5遺伝子のみではなく、RGS family にも複数あることが判明した。siRNAを用いたこれまでの実験において、細胞死誘導におけるRGS5遺伝子単独の影響は、当初の予測より小さい結果であった。そのため研究の方向を再検討し、RGS family全体としての効果を調べる方向に修正した。当該年度に計画していたin vivoにおける検証までは進んでいない。

Strategy for Future Research Activity

RGS familyのうちRGS5以外の遺伝子も増加することから、それら増加した遺伝子を同時に抑制して検証することを計画している。アポトーシスを含めた細胞死誘導への影響、および細胞周期への作用、この両面への効果を検討する。

Causes of Carryover

購入を予定していた超微量分光光度計の金額に対し、交付金が不足したため購入を見合わせた。ウイルスベクターを作製できず、siRNA及び関連試薬の購入に充てる経費は大きくなったが、分光光度計を購入しなかったことが次年度使用額が生じた大きな要因である。
また、当該年度に計画していたin vivoの実験を行わなかったため、実験動物に関わる予定経費約20万円は次年度持ち越しとして使用する計画である。新たに別の遺伝子のsiRNAやアポトーシス研究試薬等を購入する必要性が生じたため、次年度使用額の残り約12万円を充てる計画である。