2017 Fiscal Year Research-status Report
肝疾患における遊離脂肪酸のオートファジー調整機序の解明
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17K15977
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| Research Institution | University of Occupational and Environmental Health, Japan |
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Principal Investigator |
荻野 学芳 産業医科大学, 医学部, 修練指導医 (70614204)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | オートファジー / 遊離脂肪酸 / 脂肪性肝疾患 / 肝細胞癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
飽和脂肪酸によって惹起される肝細胞障害に対する不飽和脂肪酸の抑制効果が、オートファジーを介していること、筋小胞体カルシウムATPase (sarco/ER Ca2+ ATPase :SERCA)の機能が関与するという結果を、第53回日本肝臓学会総会および第49回日本臨床分子形態学会総会で発表した。他のSERCA阻害剤としてcyclopiazonic acidを用いた場合も、前述の仮説を支持する結果が得られている。蛋白合成系である小胞体へのストレス(ER stress)が、蛋白分解機構であるオートファジーに影響を与える可能性を考慮し、ER stress誘導剤として異常蛋白を蓄積させるtunicamycin、puromycinを用いた実験を行ったが、不飽和脂肪酸の抑制効果に影響しなかった。このことは、ER stress自体よりも、小胞体内のカルシウム貯留量が、遊離脂肪酸のオートファジ―調整機構に関連していると考えられた。Fluo-4を用いた小胞体内のカルシウム測定実験でも同様の結果が得られている。これらは、脂肪性肝疾患に対して、SERCAという蛋白が新たな治療目標となる可能性を示唆する研究結果と考えられる。
免疫染色の結果から、飽和脂肪酸が肝細胞に惹起する細胞死は、cleaved caspase 3依存性のアポトーシスであったが、多価不飽和脂肪酸が惹起する細胞死は、アポトーシス関連蛋白の発現がなく、形態学的にもアポトーシスとは異なる細胞死と考えられた。多価不飽和脂肪酸は肝癌細胞に対して、オートファジーのinductionを強く亢進させる結果も得られており、細胞死への新たな機序が想定される。この結果は、治療選択の少ない肝細胞癌への新たな治療方法へとつながる可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
SERCAの活性化剤であるgengerole (Nametama I, Eur J Pharmacol, 2013)を用いた実験では、飽和脂肪酸の細胞障害に対する抑制効果は得られなかった。他の活性化剤であるellagic acid やCDN1163(Kang S, J Biol Chem, 2016)を用いて検討を行う予定である。SERCAの機能解析では、ATPを用いたNADHの吸光度測定方法を行うも再現性が得られなかった。SERCAの可溶化ができていない可能性があり、lysis bufferを再調整する予定である。また小胞体分画サンプルを調整して再度解析を行っていくことも検討している。
肝癌培養細胞株に対する多価不飽和脂肪酸の抗腫瘍効果について、形態学的な解析は或る程度進んでいるが、定量的な解析がうまくいっていない。核の染色を用いたフローサイトメトリーでの解析やLDH cytotoxicity detection kitで再検討していく予定である。
多価不飽和脂肪酸は肝癌培養細胞株に対して、オートファジーのinductionを亢進させるデータが得られているが、分解基質蛋白であるp62／Sequstosome1の発現も上昇していた。この結果は予想に反するものであり、オートファジーによる分解に比べて蛋白合成が上回っている可能性も考えられた。mRNAの発現をPCRで確認することと、場合によっては蛋白分解の定量的な解析も検討される。
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| Strategy for Future Research Activity |
現時点の研究結果から、肝細胞レベルでは、飽和脂肪酸のオートファジー障害に対して不飽和脂肪酸が抑制作用をもち、その効果がSERCAが介する小胞体内のカルシウム濃度と関連していることが判明した。SERCA蛋自体の発現や機能の解析方法について再現性のある手技を確立させ、薬剤およびgeneticな手法で機能を変化させた場合の、肝細胞でのオートファジーのphenotypeを確認する。さらに免疫沈降やプロテオーム解析によってSERCAの機能を変化させるような結合蛋白の同定まで行っていく予定である。
多価不飽和脂肪酸の抗腫瘍効果とオートファジーの関連性については、オートファジー関連蛋白(Atg7、Beclin1)についてgeneticな手法で発現を変化させ、その効果がどのように変化するのかを解析していく予定である。
これらの実験結果をふまえて、マウスでの実験系まで進めていきたい。
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| Causes of Carryover |
本研究は助成金申請前より続行しており、培養細胞を用いたウエスタンブロッティングや免疫染色に使用する抗体や試薬は既存のものを使用可能であった。また、SERCAの蛋白発現および機能の解析、SERCA活性化剤を使用した実験系、多価不飽和脂肪酸による肝細胞死の定量的解析、オートファジー分解基質蛋白の解析が遅れている経緯があり、次なる実験へ移行できなかったことが理由として挙げられる。次年度では、遅れている実験の解析が上手く行かなかった場合に必要となる試薬の購入や、予定されていた核酸解析および遺伝子操作に必要な試薬、免疫沈降およびプロテオーム解析の経費などが必要となる。これらのために当該助成金と翌年度分を併せた助成金の使用が考慮される。
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Research Products
(3 results)
