2017 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of tumor-associated microRNAs in hyperparathyroidism
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17K16099
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
金井 厳太 東海大学, 医学部, 講師 (00535221)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 副甲状腺機能亢進症 / microRNA / 次世代シーケンサー / 慢性腎臓病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、miRNAの網羅的解析により、副甲状腺受容体を介して機能を制御するmiRNAを同定する。また、組織および体液中のmiRNA発現量は制御するタンパク質の発現量と反比例することから、受容体の発現制御に関わるmiRNAも受容体の発現低下と反比例して発現量が増幅すると推測し、腫瘍化や機能制御に関連するmiRNAがSHPTの進展予測および治療抵抗性のマーカーとして機能するかを検証する。
摘出標本を用いた網羅的miRNA解析では、二次性副甲状腺機能亢進症患者から摘出した副甲状腺の重量を計測し最大腺および最小腺より、得られたRNAを用いてNGS RNAシーケンサー（illumina）を使用しmiRNAを網羅的に解析を行った。最大腺（受容体発現陰性細胞）と最小腺（受容体発現陽性細胞）間でのmiRNAの発現量を比較し、受容体分子の発現制御に関連すると想定されるmiRNAを絞り込む。副甲状腺組織から抽出したtotal RNAからMiSeqを用いてsmall RNA sequencingを実施した。Small non-cording RNA配列マッピングにはhuman miRNA database(miRBase)を利用した。
抽出された配列の21.67%がdatabaseに一致した。上位50の配列においてmiR-27bの発現が最も多く、最小腺に比較してmiR-10は4.5倍の発現を認めた。最大腺および最小腺に特異な18配列ではmiR-134とmiR-211が特徴的な発現を示した。代表的な20配列においてmiR-486の発現低下が認められた。未知のSmall non-cording RNAにおいてもいくつかの配列で有意差が認められた。副甲状腺重量で異なるこれらmiRNAが副甲状腺の増殖・分泌に関わる転写後調節に影響する可能性が示唆された。今後、更に詳細なSmall non-cording RNAについての機能解析が必要である。
摘出副甲状腺をコラゲナーゼ処理後、24 wellプレートに播種することで初代培養系を確立した。組織での発現変化から同定した4つの候補miRNAについて、培養系での発現を検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、miRNAの網羅的解析により、副甲状腺受容体を介して機能を制御するmiRNAを同定する。また、組織中のmiRNA発現量は制御するタンパク質の発現量と反比例することから、受容体の発現制御に関わるmiRNAも受容体の発現低下と反比例して発現量が増幅すると推測される。最小腺に比較して最大腺では特定のmiRNA発現は有意に上昇していたことから、疾患の進展による受容体発現減少とmiRNA発現には何らかの関連があると予想されるが、その機能に関しては不明な点が多く、同定されたmiRNAの阻害による受容体発現の検証が必要である点から、おおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
副甲状腺培養細胞を用いたmiRNA解析：副甲状腺培養細胞における受容体分子のknockdownおよびnegative control細胞よりTotal Nucleic Acid Isolation kit（ambion）を用いmiRNAを含む全RNAを抽出精製する。摘出副甲状腺をコラゲナーゼ処理後、24 wellプレートに播種することで初代培養系を確立した後、組織での発現変化から同定した4つの候補miRNAについて、培養系での発現を検討する。定量PCR法を用いて候補miRNAの発現を確認し、これらのmiRNA inhibitorを用いて副甲状腺細胞培養を行い、一定期間におけるこれらの培養細胞のVDR・CaSR、FGFR1、Klotho、Caveolin-1、Megalin発現や相関反応について検証する。
手術前後の患者血液を採取後、超遠心分離法によりmiRNA を内包するエクソソームを分離し、miRNAを含むRNAを抽出後、定量PCR法により組織中で確認された候補miRNAが検出可能か検討する。
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| Causes of Carryover |
概ね予定通りに使用されたが、一部物品の価格変動が発生したため。次年度使用額については翌年度分として請求した助成金と合わせて細胞培養関連試薬を購入する予定である。
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