2018 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
17K16100
|
|---|
| Research Institution | Tokai University |
|---|
Principal Investigator |
小泉 賢洋 東海大学, 医学部, 講師 (30566170)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 糸球体線維化 / I型コラーゲン / 質量分析計 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
線維化組織で蓄積するⅠ型コラーゲンは，通常2本のα1(I)鎖と1本のα2(I)鎖から成るheterotrimerである．申請者等は，高率に再現性よく糸球体硬化症の誘導が可能なマウスモデルで検討し，硬化糸球体ではα1(I)鎖mRNAが増加しα2(I)鎖mRNAが減少することを見出した．本申請の研究では，糸球体研究では活用されてこなかった質量分析法を用いてⅠ型コラーゲンを解析し，糸球体硬化症ではα1(I)2α2(I) heterotrimerからα1(I)3 homotrimerへと変容するという仮説の検証を行う．従来見逃されていたこの概念の証明は，MMPで分解されないコラーゲンの蓄積を伴う糸球体硬化症が，糸球体外（腎尿細管間質）や他臓器の線維化と全く異なったメカニズムで発症することを示し，糸球体硬化症の根本的治療法の開発に繋がることが期待される．
H30年度は，質量分析計を用いたI型コラーゲン測定系の構築を行った．I型コラーゲンα1鎖，α2鎖に特異的なペプチド(それぞれ，GAAGPPGATGFPGAAGR，EGPVGLPGIDGRPGPIGPAGPR)を同定し，定性的な検討が可能となった．定量的な検討を行うべく，これらのペプチドの合成を外部機関に依頼している．糸球体からのI型コラーゲン抽出に関しては，レーザーキャプチャー法による凍結切片からの糸球体の切り抜きも検討したが，当初の磁気ビーズを潅流させる方法が有効であることから，この方法にて採取した糸球体にペプシン溶解と塩析を行いI型コラーゲンを抽出することとした．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
糸球体からのI型コラーゲンの抽出系の構築に時間を要している．腎組織のうち糸球体が占めている体積は僅かであり，その糸球体に含まれているI型コラーゲンを効率に回収する為に実験系の調整を行った．ペプシン溶解・塩析・超遠心を用いた方法が有効であると期待される．
|
| Strategy for Future Research Activity |
正常・傷害糸球体より安定したI型コラーゲン抽出が可能となり，合成ペプチドを用いた質量分析によりα1鎖とα2鎖の定量検査が可能になると期待される．更に，α1鎖homotrimerより構成されるI型コラーゲンの硬化糸球体における蓄積を，低真空条件での走査型電子顕微鏡を用いて観察することを予定している．
|
| Causes of Carryover |
質量分析によるI型コラーゲン測定系の構築に時間を要し，予定していた実験計画を進めることが出来なかった為．今後，ペプチドの合成等，研究費を要する研究を行う予定である．
|
