マイコプラズマ感染関節リウマチマウスモデルの滑膜組織変化と獲得免疫関与の検討

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K16217
• Research Institution: Kawasaki Medical School
• Principal Investigator: 矢作 綾野 川崎医科大学, 医学部, 助教 (10584873)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 関節炎動物モデル / gp130F759 / Mycoplasma fermentans

Outline of Annual Research Achievements

1.滑膜組織造血・非造血系細胞における病変の時間空間的解析：関節リウマチの主病変となる滑膜表層は2種類の細胞、マクロファージ様のTypeA滑膜細胞と線維芽細胞様のTypeB滑膜細胞から構成される為、各々が検出できるCX3CR1-GFP、Col1a1-ECFP tgを川崎医科大学SPF飼育室へ搬入後、gp130F759と交配した。CX3CR1GFP/+ gp130F759の作出は少数ながら成功し、滑膜におけるCX3CR1GFP/+の存在を検討した。膝滑膜から細胞を回収し、フローサイトメトリー(FCM)を用いてCX3CR1陽性細胞を確認したところ、6.7%存在した。しかし、この中には血液内に循環するCX3CR1陽性細胞も含まれる可能性があったことから、PBSにて全身を還流後、FCMにて確認したところ、4.2%であった。この割合が本来滑膜組織に存在するCX3CR1陽性細胞と考えられる。さらに局在を検討する為、川本テープ法にて関節滑膜の薄切切片を作成後、蛍光顕微鏡にて陽性細胞の有無を確認したが、蛍光を認めなかった。そこで抗GFP抗体を用いて陽性細胞を検出したところ、野生型では極少数であるが滑膜表層に、CX3CR1GFP/+ gp130F759では滑膜内の線維化部分にも陽性細胞が存在した。Col1ECFP/+gp130F759の作出はやや遅れている。
2. 関節炎惹起での獲得免疫関与検討：Mf感染におけるT細胞の関与を明確にするため、gp130F759nu/nuを作成したが、発育不良のためgp130F759と同等に扱うことはできないと判断した。
3. Mf感染から関節炎発症までに関与する信号伝達経路の解析と新たな治療戦略：IL-6KO/gp130F759を作出した。自然経過の観察からgp130F759におけるMf感染と解析時期の3-4ヶ月齢において関節炎の発症を認めないことを確認した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CX3CR1GFP/+ gp130F759、Col1-ECFP Tg /gp130F759、IL-6KO/gp130F759の作出において実験に使用予定する十分なマウス数を産出することができなかったため、やや遅れているとの区分とした。特にCol1-ECFP Tgの搬入は年明けとなり当初の予定から遅れたが、現在Col1-ECFP Tg とgp130F759のF1が得られており、Col1-ECFP Tg /gp130F759の作出は来年度7月以降を予定している。一方、CX3CR1-GFP/gp130F759とIL-6KO/gp130F759は今年度中に感染実験前の状態を調べることで基礎データを獲得でき、来年度行う感染実験との比較が容易であると考えている。また、来年度以降計画している関節炎惹起での獲得免疫関与検討においても多くのgp130F759が必要となる。こちらは現在十分な繁殖マウスを準備できているので、来年度以降は安定した産出が見込めるため、実験遂行に問題はない。

Strategy for Future Research Activity

1)Mycoplasma fermentans (Mf)感染後の関節におけるMfの局在を検証する。Mfを蛍光色素で標識し、CX3CR1-GFP/gp130F759, Col1-ECFP Tg /gp130F759へ感染させる。感染後経時的に滑膜組織（膝滑膜、後肢関節）を還流後2%パラホルムアルデヒドで固定、スクロース置換後、凍結包埋する。川本テープ法を用いて薄切し共焦点レーザー顕微鏡にてMfの局在を確認する。さらに線維芽細胞はFLSに対する抗体(抗カドヘリン11抗体)を用いて染色し線維芽細胞とMfの局在の関連性を確認する。
2)関節炎惹起での獲得免疫関与検討では来年度以降gp130F759nu/nuではなく、抗体投与による細胞除去を考えている。抗CD79b抗体、抗CD4あるいはCD8抗体 でリンパ球(B,T細胞)を除去し、感染１か月後まで関節炎発症の有無を検討する。
3)-1 IL-6KO/gp130F759を用いた感染実験または抗IL-6受容体抗体による阻害実験を行う。3)-2 マイコプラズマ肺炎の治療で行われる抗生剤(マクロライド系、ニューキノロン系)投与がMf感染での関節炎発症を抑制できるのか、検討する。

Causes of Carryover

今年度は新規動物をSPF飼育へ検疫後、搬入し、当該施設で所有するマウス(gp130F759)との交配により新たなマウスの作出を行った。IL-6KO/gp130F759はIL-6/TNFR1の二重欠損マウスとgp130F759を交配し得られたF1の中から再交配後IL-6KO/gp130F759を作出したため、時間を要した。来年度はCX3CR1-GFP/gp130F759、IL-6KO/gp130F759、gp130F759の安定した量産が見込めるため、産出できたマウスから感染実験を開始する。また、Col1-ECFP Tg /gp130F759も後半期には実験開始可能である。今年度機器購入を行わなかったが、来年度以降の実験遂行に必須であることから、２９年度の残額は来年度早々に使用予定である。