2018 Fiscal Year Research-status Report
Molecular-based analysis of autosomal dominant woolly hair/hypotrichosis
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17K16329
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
藤本 篤 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (10571937)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ケラチン71 / 縮毛症 / 毛包分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
先天性毛髪疾患である常染色体優性遺伝性縮毛症および乏毛症の原因はKeratin71 (KRT71)遺伝子の変異であることが分かっている。しかしながら、Keratin71の毛包分化における正確な役割や変異によって縮毛症を発症する病態については未だ明らかでない。
本研究は、縮毛症を呈するマウスから得たkaratin71 (Krt71) の新規変異(c.1117_1123del7ins10 (p.L373_T375delinsSLLS))について、変異によって毛包の形態、機能がどのように変化するかを詳細に解析する。また、毛包内毛根鞘に発現している様々な転写因子について、培養細胞を用いてKRT71遺伝子のプロモーター解析を行い、遺伝子の発現調節機構を明らかにすることを目的とする。
平成31年度は、Krt71遺伝子の上記変異を導入したHaCaT (human keratinocyte) 細胞およびPtk2 (kangaroo rat kidney epithelial) 細胞を蛍光二重染色法で解析した。結果、変異型のkeratin71は、HaCaTの細胞の内在性のタイプIケラチンであるkeratin 14とのヘテロ二量体形成不全に陥り、核周囲に凝集していることを確認した。これらの結果と先行研究により得られた知見、すなわち走査型電子顕微鏡での詳細な形態学的観察および免疫組織化学染色法での毛包におけるkeratin71の発現パターンとの関連を解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の研究計画では、変異型のkeratin71がケラチン中間径フィラメントの形成に及ぼす影響について、培養細胞を用いた蛍光二重染色法で解析結果を得る予定であり、これについては概ね予想された通りの結果を得ることができた。しかしながら、続いて計画していたヒトのKRT71遺伝子の発現制御機構の解析については、KRT71遺伝子プロモーターおよび毛包内毛根鞘に発現する転写因子のクローニングが完了しておらず、行えていない。この点から計画よりやや遅れていると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成31年度はヒトのKRT71遺伝子のプロモーター領域をpGL4.12ベクターにクローニングする。また毛包内毛根鞘に発現している様々な転写因子をpCXN2ベクターにクローニングする。それらをHEK293T (human embryonic kidney) 細胞、HeLa (human cervical cell carcinoma) 細胞などの培養細胞に導入し、KRT71遺伝子のプロモーター活性をルシフェラーゼレポーターアッセイで解析する。KRT71遺伝子のプロモーター活性を有意に上昇させる転写因子が見つかった場合は、その転写因子についてクロマチン免疫沈降を行って、 KRT71遺伝子のプロモーター領域に転写因子結合部位が存在をすることを示す。
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| Causes of Carryover |
当初の研究計画では、変異型のkeratin71がケラチン中間径フィラメントの形成に及ぼす影響について、培養細胞を用いた蛍光二重染色法で解析結果し、さらにヒトのKRT71遺伝子の発現制御機構の解析を行う予定であった。しかしながら、前年度からの研究計画の遅れにより、KRT71遺伝子プロモーターおよび毛包内毛根鞘に発現する転写因子のクローニングを完了できなかった。
平成31年度はヒトのKRT71遺伝子のプロモーター領域をpGL4.12ベクターにクローニングする。また毛包内毛根鞘に発現している様々な転写因子をpCXN2ベクターにクローニングする。それらをHEK293T (human embryonic kidney) 細胞、HeLa (human cervical cell carcinoma) 細胞などの培養細胞に導入し、KRT71遺伝子のプロモーター活性をルシフェラーゼレポーターアッセイで解析する。KRT71遺伝子のプロモーター活性を有意に上昇させる転写因子が見つかった場合は、その転写因子についてクロマチン免疫沈降を行って、 KRT71遺伝子のプロモーター領域に転写因子結合部位が存在をすることを示す。これらの過程で、技術的な問題が生じた場合、ベクターの作成を外注する、他の研究機関の協力、助言を得るなどの対策を行う予定である。
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