2018 Fiscal Year Research-status Report
炎症性皮膚疾患の病態形成に関わる抗菌ペプチドmBD14の発現制御機構の解明
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17K16346
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
広瀬 晴奈 大分大学, 医学部, 病院特任助教 (50750915)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 抗菌ペプチド / defrnsin / TRAF6 / 黄色ブドウ球菌 / 炎症性皮膚疾患 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、何らかの原因で抗菌ペプチド（defensin-3, hBD3）の発現が減少して皮膚細菌叢の恒常性が破綻すると、黄色ブドウ球菌が増加してアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患が悪化すると考えられている。hBD3は、病原体センサーであるToll様受容体（TLR2）や炎症性サイトカイン（TNFα，IL-1）のシグナルによって誘導されると考えられているがその詳細は不明である。本研究は、TLR/IL-1Rシグナルを伝達するTRAF6に着目し、生体内の皮膚組織におけるhBD3の誘導機序を分子レベルで解明する。そこで、マウスのhBD3オーソログであるmBD14の発現誘導機構を明らかにするため、ケラチノサイトやランゲルハンス細胞に特異的TRAF6欠損マウスに黄色ブドウ球菌（S.aureus）を皮膚感染させ、mBD14の誘導、S.aureusの感染レベル及び皮膚炎症病態を解析する。
初年度では、ケラチノサイトやランゲルハンス細胞で特異的にTRAF6を欠損するマウスを作製するため、TRAF6 floxマウスをK5-CreマウスならびにCD11c-Creマウスと交配した。また、S.aureus皮膚感染モデルを作製するため、条件検討し、菌液塗布後にmBD14の発現レベルを評価する系を確立できた。
ケラチノサイトならびにランゲルハンス細胞で特異的にTRAF6を欠損するマウスにS.aureusを感染させたところ、皮膚組織内のmBD14のmRNA発現レベルがケラチノサイト特異的TRAF6欠損マウスで著しく障害されていることを見出した。一方、ランゲルハンス細胞特異的TRAF6欠損マウスでは正常にmBD14のmRNAが上昇したことから、各組織におけるTLR-TRAF6シグナルの役割に違いがあることが明らかになった。これらの発見は当初予想していなかったもので、本実験により初めて明らかになった事実である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度ではの再現性を確認するため、S.aureus皮膚感染モデルにおけるmBD14のmRNA発現レベルの解析を3回繰り返し、同様の結果が得られた。さらに、皮膚組織におけるmBD14の局在を明らかにするため、コントロールマウス、ケラチノサイト特異的TRAF6欠損マウス、ランゲルハンス細胞特異的TRAF6欠損マウスの皮膚にS.aureus懸濁液を塗布し、マウスの皮膚を採取し、mBD14の免疫染色を行った。バックグラウンドが高く、また非特異的な発色がみられているため、現在、至適条件を検索中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までに、S.aureus感染によるmBD14の発現上昇がケラチノサイト特異的TRAF6欠損（K5-CreTRAF6）マウスで著しく障害されていることを見出した。
次年度では、ケラチノサイト特異的TRAF6欠損（K5-CreTRAF6）マウスやランゲルハンス細胞特異的TRAF6欠損（CD11c-CreTRAF6）マウスにS.aureusを感染させ、背部皮膚組織を数日後に切除し、重量を計量した後、皮膚組織のホモジネートを血液寒天培地で培養する。コロニー数を計測することで組織1ｇあたりのS.aureusの菌数を算出することで各マウスにおける感染レベルを明らかにする。また、同時に感染部位のHE染色、S100タンパク染色、トルイジンブルー染色などの病理組織標本を作製し、単位面積あたりの表皮の厚さ、炎症細胞浸潤（リンパ球、好酸球、肥満細胞）を半定量的に解析する。さらに、同組織のIL-1β、TNF-α及びTARCの発現レベルをreal-time PCR法およびELISA法にてmRNAレベルおよびタンパクレベルで解析する。また、アトピー性皮膚炎患者においてIL-4が上昇していることから、アトピー性皮膚炎モデルマウスにおけるIL-4の影響を解析する。具体的にはS.aureus感染時にmIL-4を皮内注し、mBD14やサイトカインの発現レベルにおけるIL-4の影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
S.aureus皮膚感染モデルの実験が順調に進んだ為、経費の節約に繋がった。 次年度使用分は、実験動物の飼育管理費や、実験消耗品に使用する予定である。
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Research Products
(13 results)
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[Journal Article] Dysbiosis of the Gut Microbiota on the Inflammatory Background due to Lack of Suppressor of Cytokine Signalling-1 in Mice2018
Author(s)
Gendo Y, Matsumoto T, Kamiyama N, Saechue B, Fukuda C, Dewayani A, Hidano S, Noguchi K, Sonoda A, Ozaki T, Sachi N, Hirose H, Ozaka S, Eshita Y, Mizukami K, Okimoto T, Kodama M, Yoshimatsu T, Nishida H, Daa T, Yamaoka Y, Murakami K, Kobayashi T.
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Journal Title
Inflammatory Intestinal Diseases
Volume: 3
Pages: 145～154
DOI
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[Presentation] Development of a rapid and simple reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for Chikungunya virus2018
Author(s)
Benjawan Saechue, Naganori Kamiyama, Shinya Hidano, Kaori Noguchi, Yoshiko Gendo, Takashi Ozaki, Akira Sonoda, Haruna Hirise, Nozomi Sachi, Sotaro Ozaka, Takashi Kobayashi,
Organizer
41回日本分子生物学会年会
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[Presentation] アフリカ株とアジア株SRIPsを用いた、ジカウイルスの宿主細胞侵入効率の解析2018
Author(s)
神山長慶, 渡辺 景, Benjawan Saechue, 飛彈野真也, 野口香緒里, 玄同淑子, 尾崎貴士, 園田光, 広瀬 晴奈, 小坂 聡太郎, 佐知望美, 鈴木 亮介, 小林隆志
Organizer
41回日本分子生物学会年会
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