抗癌剤耐性におけるライソゾーム酵素の機能解明と新規治療法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K16584
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 白井 祥睦 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (10785364)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 抗癌剤耐性 / Lysosome / オートファジー / 遺伝子治療

Outline of Annual Research Achievements

本研究は切除不能膵癌に対する抗癌剤耐性におけるオートファジーの役割を解明し、中でもLysosome酵素の働きに着目し、その機構を解明するものである。
近年、栄養飢餓により強く誘導されるオートファジーは癌細胞において亢進していることが示され、癌治療研究における有望なターゲットとして注目を集めている。膵臓癌においても悪性度とオートファジー亢進の関係性が示されており、オートファジー制御を目的とした治療法が研究されている。本研究では、オートファジーの実態が多様な加水分解酵素を内包する細胞内小器官であるlysosomeに依存した分解系であることに着目した。

Lysosome機能の低下とオートファジー効率の低下との関係は、ゴーシェ病やファブリー病をはじめとする種々の先天性のLysosome酵素欠損症において詳細に解析されており、基本的に1種類の酵素活性を低下させるだけでオートファジー不全が引き起こされ、細胞内に代謝不全蛋白が蓄積することで様々な症状が引き起こされる。
今回我々は、Pompe病の欠損Lysosome酵素の一つである酸性αグルコシダーゼ(GAA)遺伝子を抑制することで、膵臓癌の標準治療薬である塩酸ゲムシタビンによる抗癌剤耐性能が改善され、抗腫瘍効果が増強されることを明らかにしてきた。また、アデノウイルスベクターを用いてGAA遺伝子をノックダウンし塩酸ゲムシタビンの抗腫瘍効果が増強されることを確認している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在までに我々は、切除不能膵臓癌に対する標準治療である塩酸ゲムシタビン(GEM）をヒト膵臓癌細胞株(Panc1,MIA Paca2)に投与することで、複数のLysosome酵素遺伝子(GAA,GLA,ASAH1,IDS,IDUA等)が発現増強することを確認した。蛍光顕微鏡や電子顕微鏡においても、塩酸ゲムシタビン投与後48時間にLysosomeの発現が増強することを確認した。また、Western Blot法においても、LC3などのオートファジー関連タンパクや、GAAやGLAなどのLysosome酵素蛋白が発現増強することを確認し、GAAやGLAといったLysosome酵素の活性が有意に上昇していることを確認してきた。

次に、Lysosome酵素遺伝子の中で、糖代謝に関わると考えられた酸性αグルコシダーゼ(GAA)、酸性βグルコシダーゼ(GBA)、αガラクトシダーゼ(GLA)や、スフィンゴ脂質代謝に関わる酸性セラミダーゼ(ASAH1)に着目し、siRNA法にてこれらの遺伝子発現を抑制させることで塩酸ゲムシタビンによる細胞増殖能が抑制されることを明らかにし、また、アポトーシス関連タンパク(Cleaved caspase3,8,cleaved PARP)が発現増強することを確認した。

また、これらの遺伝子発現抑制のため、shRNAを搭載したアデノウイルスベクターを作製し、現在in vivoにてその効果を検証している。同時に、これらの遺伝子抑制が抗腫瘍効果を誘導する機序についても検討している。

Strategy for Future Research Activity

現在までに、Lysosome酵素遺伝子のノックダウンにより塩酸ゲムシタビンによるアポトーシスが誘導されていることからLysosome酵素の活性化が抗癌剤耐性に関与していることが示唆された。今後はこの酵素活性の上昇と、オートファジーの亢進との関係性を解明していく。

さらに、Lysosome酵素遺伝子発現を抑制するアデノウイルスベクターを作製し、動物モデルへのベクターの投与し、治療効果を検討予定である。

Causes of Carryover

(理由)本年度実施予定であった電子顕微鏡によるオートファジー評価、及びウイルスベクター作製を、学内受託にて行うことで大幅に支出を抑えることが可能であった。そのため、当該研究にかける予定であった助成金額を次年度に使用する予定とした。

(使用計画)
電子顕微鏡による評価にて、Lyssome酵素抑制がミトコンドリアに影響を及ぼすことが確認された。そのため、Lysosome酵素遺伝子抑制がミトコンドリアの機能に及ぼす影響の検討に前年度助成金を執行する予定である。

Research Products

• [Presentation] Inhibition of lysosomal enzyme activity enhances antitumor effect of gemcitabine in pancreatic cancer cells. (2019)
  • Author(s): Hamura R, Shirai Y, Saito N, Taniai T, Shimada Y, Horiuchi T, Sugano H, Takada N, Kanegae Y, Ohashi T, Yanaga K.
  • Organizer: 14th Annual Academic Surgical Congress (ASC)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 抗癌剤耐性膵癌におけるライソソーム酵素の機能解析と遺伝子制御による塩酸ゲムシタビンの抗腫瘍効果増強の試み (2019)
  • Author(s): 羽村凌雅, 矢永勝彦, 白井祥睦, 谷合 智彦, 斉藤庸博, 嶋田洋太, 堀内 尭, 菅野 宏, 高田直樹, 鐘ヶ江裕美, 大橋十也, 大木隆生.
  • Organizer: 第119回 日本外科学会定期学術集会
• [Presentation] Suppression of lysosomal enzyme improves chemoresistance in pancreatic cancer cells. (2018)
  • Author(s): Hamura R, Shirai Y, Saito N, Taniai T, Shimada Y, Horiuchi T, Sugano H, Takada N, Kanegae Y, Ohashi T, Yanaga K
  • Organizer: 第77回 日本癌学会学術総会