腫瘍形成に関わる間質細胞由来メタロプロテアーゼ分子の機能解析

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K16617
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 志満 敏行 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (70738781)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: メタロプロテアーゼ / ADAM / CAF / 肺癌

Outline of Annual Research Achievements

癌組織では大量のメタロプロテアーゼが分泌されており、その主要な産生源として癌間質細胞が注目されている。主要な癌間質細胞である癌関連線維芽細胞（cancer-associated fibroblast: CAF）は、癌細胞との相互作用により癌進展に大きく寄与することが示されているが、これまでに申請者の研究グループではメタロプロテアーゼ活性がCAF の腫瘍促進性形質維持に重要であることを明らかにしてきた。本研究では、マウスおよびヒト肺癌間質細胞（主にCAF）で高発現するメタロプロテアーゼ分子を同定し、腫瘍形成・進展に関わる間質細胞由来メタロプロテアーゼの役割について明らかにする。
マウス由来CAF microarray database の解析から、マウス由来CAF で高発現するメタロプロテアーゼの候補分子 を同定した。平成29年度では、ヒト肺癌組織よりCAF を単離・初代培養し、ヒト肺癌由来CAF における候補となるメタロプロテアーゼ分子を含む発現解析を行った。肺癌手術材料より、CAF および正常線維芽細胞を単離し、採取部の形態学的な組織型と比較しながら、全てのADAM とMMPをスクリーニングできるPCR アレイを用いて、培養CAF におけるADAMとMMP の発現レベルを網羅的に解析し、培養ヒト由来CAF で高発現するADAM とMMP を解析し、候補となる分子を同定した。
また、PCR アレイにおいてCAF で有意に発現が上昇しているメタロプロテアーゼ に関しては、さらに、定量PCR、イムノブロット法を用いて発現解析を行った。また、蛍光ペプチドを用いて、CAF およびNAF におけるメタロプロテアーゼ活性を定量するとともに、メタロプロテアーゼのインヒビターを用いてCAF およびNAF におけるメタロプロテアーゼ活性の解析を行い、発現様式についての情報を得た。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

研究費への応募の段階では平成29年度は慶應義塾大学医学部内での業務に従事する予定であったが、4月から9月までの国立がんセンター中央病院での病理科ならびに呼吸器外科での臨床研修を行うこととなったため、予定していた実験や解析など消化することができなかったものがある。しかし、先方での臨床研修により最新の臨床病理学的知見を習得することができた。当初予定していた解析に加えて、臨床応用につなげるための構想についても追加して検討する予定である。
平成29年度10月からの県有で得られた成果としては、マウス由来CAF microarray database（マウス皮膚癌由来CAF、マウス乳癌由来CAF とこれらのcontrol fibroblast）の解析から、マウス由来CAF で高発現するメタロプロテアーゼの候補分子とを同定しえた。また、ヒト肺癌組織よりCAF を単離・初代培養し、ヒト肺癌由来CAF におけるMMP-13 を含む発現解析を行った。肺癌手術材料の癌部・非癌部組織より、CAF および正常線維芽細胞を単離し、採取部の形態学的な組織型と比較しながら、全てのADAM とMMPをスクリーニングできるPCR アレイを用いて、培養CAF におけるADAMとMMP の発現レベルを網羅的に解析し、培養ヒト由来CAF で高発現するADAM とMMP を解析し、候補となる分子を同定した。
また、PCR アレイにおいてCAF で有意に発現が上昇しているメタロプロテアーゼとMMP-13 に関
しては、さらに、定量PCR、イムノブロット法を用いて発現解析を行った。また、蛍光ペプチドを
用いて、CAF およびNAF におけるメタロプロテアーゼ活性を定量するとともに、メタロプロテア
ーゼのインヒビターを用いてCAF およびNAF におけるメタロプロテアーゼ活性の解析を行い、発現様式についての情報を得た。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度の計画予定に組み込まれていた同所性肺癌移植モデルを用いた実験については、モデル自体はすでに確立されているが、まだ実験が行えていないため、早急にこちらに着手する予定である。しかし、異所性癌移植モデルについてはすでに複数例の検体の採取が完了しているため、こちらの解析を行いながら、並行して同所性移植モデルの実験を進める。すでに、異所性移植モデルにおいてMMPKOマウスにおいては肺癌株の腫瘍進展が抑制されることが判明しているため、同所性モデルにおける肺癌株の生着が進まず、リンパ節転移部位の組織採取や解析が困難となる可能性がある。その場合は肺局所での腫瘍細胞や間質細胞の組織学的変化の解析に対象を絞り、MMP13の解析を行う。
また、ヒト肺癌手術検体のパラフィン切片を用いて、腫瘍内におけるMMP-13 発現細胞の同定を行う予定である。具体的には、免疫染色法により上皮細胞、活性化線維芽細胞、マクロファージなどに対する特異的マーカーとの二重染色を行い、MMP-13 高発現細胞を特定するとともに、年齢・ドライバー遺伝子変異の有無、肺癌の腫瘍径・分化度・静脈侵襲の有無、予後等の臨床病理学的因子臨床情報との関連を検討する。

Causes of Carryover

平成29年度の4月から9月の間に国立がんセンター中央病院の病理科ならびに呼吸器外科へ勤務の命令があり、臨床病理業務ならびに呼吸器外科の臨床業務に従事した。その間は課題研究への従事が困難であったため、新たな必要物品の購入や国内学会や海外学会への参加もできず、予定していた予算の使用ができなかった。
平成30年度は前年度に比して臨床業務の負担が予想されることから、研究に従事するための時間の確保が容易となるため、前年度に予定していた実験を進めていく予定である。また、実験データの解析のために新たなPCの購入や、研究成果の発表のために各種学会への参加を予定している。