2017 Fiscal Year Research-status Report
軟骨細胞シート分泌エクソソーム中の軟骨形質マーカーとなるmiRNAの解析
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17K16705
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
前原 美樹 東海大学, 医学部, 特定研究員 (40794102)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 再生医学 / 軟骨細胞 / 細胞シート / エクソソーム / miRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
関節軟骨損傷に対する軟骨細胞シート移植による関節治療の実施に際し、細胞シートの軟骨形質発現を非侵襲的に検査する方法が望まれている。細胞が培養上清中に放出するエクソソーム(膜小胞体)にはmiRNAが含まれており、細胞シートの培養上清から得られるエクソソームは細胞シートの軟骨形質発現と相関することが予想され、軟骨形質発現のマーカーとして利用できる可能性がある。本研究の目的は、ヒト軟骨細胞シートが培養液中に放出するエクソソームに内包されるmiRNAをマイクロアレイにより解析し、軟骨形質発現のマーカーとなるmiRNAを同定すること、また、同定されたmiRNAがターゲットとする遺伝子を特定し、細胞シートの軟骨修復効果への寄与について解明することである。本年度は、研究計画に従い、下記の実験を実施した。
1. ７ドナーの多指症患者由来軟骨細胞から作製した細胞シートおよびその培養上清中エクソソームに内包されるmiRNAを抽出し、培養上清中エクソソームで有意に発現が変動するmiRNAをマイクロアレイ解析により絞り込んだ。
2. ６ドナーの多指症患者由来軟骨細胞から、異なる培養条件下にて2種類の細胞シートを作製し、軟骨形質および組織修復能が大きく異なることを確認した。これらの細胞シート培養上清中エクソソームに内包されるmiRNAを抽出し、軟骨修復能の優れた培養条件で有意に発現が変動するmiRNAをマイクロアレイ解析により絞り込んだ。
3. 1. および2. の実験結果において共通する変動miRNAの絞り込みを行い、軟骨形質発現マーカー候補となる複数種のmiRNAのスクリーニングを完了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞シートがエクソソーム中に積極的にパッケージングするmiRNAの中で、軟骨修復能の高い細胞シートのみに発現が認められるmiRNAを特定し、本年度計画していた軟骨形質マーカー候補となるmiRNAのスクリーニングを終了することが出来た。現在、リアルタイムPCRを用いた定量試験を実施しているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
PCRによる定量試験を経て決定した、軟骨形質マーカーとして適したエクソソーム由来miRNAの機能解析を行う。軟骨細胞、もしくは軟骨方向へ分化誘導処理を施した幹細胞等に対し、同定したmiRNAのインヒビターを用いた機能阻害や、発現ベクターを用いた過剰発現誘導等の手法を施すことにより、遺伝子発現量の変化や、既存の硝子軟骨マーカーの遺伝子発現量との相関等を明らかにすることでターゲット遺伝子を同定し、細胞シートの軟骨修復機構との関連について解析する。
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| Causes of Carryover |
解析サンプル数が予定数よりも若干減少したこと、解析の外部委託が予定より安価に実施できたこと、学会旅費等が不要となったことにより、次年度使用額が生じた。繰り越した予算は、遺伝子阻害や導入実験のための試薬購入や試験外注、国内および国外学会発表、論文投稿のための費用に充当する。
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[Presentation] ANALYSIS OF MICRO-RNAS IN EXOSOMES SECRETED BY HUMAN POLYDACTYLY-DERIVED CHONDROCYTE SHEETS2018
Author(s)
E. TOYODA, M. SATO, M. MAEHARA, T. TAKAHASHI, T. TAKAGI, K. NONAKA, H. IIJIMA, R. MATOBA, H. AKUTSU, A. UMEZAWA, T. AKAMATSU, M. WATANABE
Organizer
2018 World Congress on Osteoarthritis
Int'l Joint Research
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