2018 Fiscal Year Research-status Report
神経障害性疼痛における選択的スプライシング異常を標的とした新規治療法の検討
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17K16758
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
丸山 基世 日本医科大学, 医学部, 助教 (60709757)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 疼痛関連lncRNA / 選択的スプライシング / RNA結合タンパク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経害性疼痛は体性感覚系の障害に起因する難治性の慢性疼痛であり、既存の鎮痛薬の効果は十分でなく、鎮痛薬の副作用も治療の妨げとなっている。既知のメカニズムに基づいた治療候補は未だヒトにおける有効性を見出せておらず、新たな視点から疼痛の病態分子機構を解明する必要がある。
近年、選択的スプライシングの調節異常が多くの疾患で報告されてきており、重要な治療標的の候補になりうるが、神経障害性疼痛に対する関与はほとんど明らかになっていない。この背景には選択的スプライシングの複雑な調節機構や効率的な解析手段の欠如が病態分子基盤の理解を妨げていると考えられる。
タンパクをコードしない機能性RNAとして細胞内に豊富に発現する非コードRNAの中でも長鎖非コードRNA（lncRNA）は半数以上が神経系に発現しており、神経機能における重要性が示唆されているにも関わらず神経障害性疼痛における役割はほとんど明らかになっていない。我々は神経障害性疼痛において選択的スプライシング異常が広範に生じていること及びその主要調節因子であるlncRNAが神経障害性疼痛に関与していることを見出した。
従って、本研究ではlncRNAの解析を通して、神経障害性疼痛における選択的スプライシング異常を解析することを目的とした。すでに選択的スプライシングの制御因子であることが報告されているlncRNAを足掛かりとし、これらlncRNAが調節するスプライシング調節タンパク及び選択的スプライシングが変化する遺伝子を同定し、新規の治療標的としての可能性を検討する。本年度は一次感覚神経において、疼痛に寄与するlncRNAに対して特異的に結合するスプライシング制御タンパクを同定し、lncRNAの疼痛に寄与するメカニズム解明のための基盤研究を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々はRNAシーケンスにより、神経障害性疼痛モデル動物の一次感覚神経において、選択的スプライシングの調節因子の1つである特定のlncRNA の発現が増加することを見出した。また、in situ hybridization法を用いて、スプライシングの場である核内に主に発現していることを明らかにした。lncRNAの配列に対するshort hairpin RNAを組み込んだアデノ随伴ウイルスベクターにより一次感覚神経特異的に遺伝子導入を行った結果、lncRNAの発現抑制により、神経傷害後の機械的刺激及び熱刺激に対する逃避行動が有意に減弱した。パスウェイ解析により、疼痛行動が緩和した動物において神経傷害後の遺伝子発現変化の多くが抑制されており、その中には神経機能や炎症プロセスに関わる遺伝子が多く含まれることが明らかになった。
lncRNAはRNA結合タンパクとの相互作用を介して遺伝子発現調節に関与する。特にスプライシング調節タンパクの多くは組織特異的な発現を示すため、本年度は一次感覚神経において疼痛に寄与するlncRNAに特異的に結合するスプライシング調節タンパクの同定を試みた。ビオチン標識したlncRNAに結合する一次感覚神経由来タンパクをストレプトアビジンビーズを用いてプルダウンし、マススペクトロメトリーにより同定した。多くのRNA結合タンパクが同定され、選択的スプライシングに必須なタンパクが含まれていた。また、RNA免疫沈降法を用いて、これらタンパクとlncRNAとの結合が確認でき、lncRNAと選択的スプライシング調節タンパクとの直接の相互作用を示すことができたためおおむね順調に進んでいると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
疼痛関連lncRNAに結合するスプライシング調節タンパクの遺伝子発現操作をすることにより、神経障害性疼痛への関与を検討する。我々は今回同定したスプライシング調節タンパクの内、hnRNP A1が一次感覚神経において、末梢神経障害に伴って核内移行することを見出しているため、hnRNP A1を先行して解析を進める。
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| Causes of Carryover |
外注でRNA関連試薬を購入する予定であったが、数種類のprobeを試すことになり、試薬が高額なため、次年度申請額と合わせて購入を計画している。
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