循環腫瘍DNAに着目した腎癌特異的変異の同定とリキッドバイオプシーへの臨床応用

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K16789
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 石津谷 祐 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (00783854)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: cell free DNA

Outline of Annual Research Achievements

腎細胞癌の病理組織像の種類は複数あるため、本研究は腎細胞癌の遺伝子変異に着目した研究であり、集団を均一にする目的で、最も高頻度の淡明細胞型腎細胞癌(ccRCC)に絞って研究を開始した。腎細胞癌患者の治療前の血漿からQIAamp circulating nucleic acid kit(QIAGEN社)を用いて、cell free DNA(cfDNA)を抽出した。CfDNAの存在は、蛍光光度計、定量的リアルタイムPCR法ならびにマイクロチップ型電気泳動装置にて確認した。続いて、腎細胞癌特異的なctDNAをターゲットシークエンスで検出するために、公共データベースの約2万種類の遺伝子の中から、変異頻度や腎細胞癌発生・増殖のpathwayへの関連、分子標的治療薬の標的遺伝子を考慮して、標的遺伝子を48個に絞り込み、腎癌カスタムパネルを作成した。本研究は微量なcfDNAのシークエンスを行うため、特定の領域をより重点的に深くシークエンスする必要があり候補を絞った。遺伝子変異パネルは、Agilent社のSureSelectのカスタムパネルを選択し、当キットは微量なDNAのシークエンスライブラリー作成に適している。シークエンスは、癌細胞由来ゲノムDNA、リンパ球由来ゲノムDNA、cfDNAを次世代シークエンサーにて比較解析を行い、患者固有の腎細胞癌特異的遺伝子変異を同定し、ctDNAを同定する方針とした。次世代シークエンサーはHiSeq2500を使用した。本法は増幅したアンプリコンをターゲットシークエンスする方法であるため、微量なctDNAに対しても最適である。解析は東大のスーパーコンピューターにインターネット接続して行い、解析pipelineはGenomon2を使用した。5例でシークエンスを行い、全例癌ゲノムで変異を検出した。CfDNAの変異解析は、現在進行中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

腎細胞癌特異的変異パネルを作成し、癌ゲノムで変異を同定し、パネルが妥当であることを確認した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、腎細胞癌におけるcfDNA中に遺伝子変異を同定して循環腫瘍DNAを探索する。

Causes of Carryover

研究を進めていくうえで必要に応じて研究費を執行したため、当初の見込み額と執行金額が異なった。