子宮頸癌におけるPIK3CA遺伝子変異をターゲットとした新規分子標的治療の探索

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K16828
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 秋山 梓 筑波大学, 医学医療系, 講師 (80647272)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 子宮頸癌 / シスプラチン併用同時化学放射線療法 / PI3-kinase/Aktシグナル伝達経路 / PIK3CA遺伝子

Outline of Annual Research Achievements

局所進行子宮頸癌の標準治療はシスプラチン併用同時化学放射線療法であるが、その5年生存率は30～50%と未だ不良であり、新規治療戦略の開発が強く望まれ る。PI3-kinase/Aktシグナル伝達経路は多くの癌において発癌機序に関与する重要な経路であり、PI3-kinaseを構成する触媒サブユニットであるp110α蛋白を コードするPIK3CA遺伝子は、子宮頸癌の13～36%に変異が報告されている。また、PI3-kinase/Aktシグナル伝達経路はシスプラチン耐性および放射線耐性の双方 に関与することが知られているが、PIK3CA遺伝子変異とCCRTによる反応性・予後との関連性の報告はこれまで非常に数少ない。そこで、局所進行子宮頸癌におけ るPIK3CA遺伝子変異の予後への関連性を明らかにするために、シスプラチン毎週投与併用同時化学放射線療法を施行したIII～IV期子宮頸癌50症例において、 PIK3CA遺伝子変異を解析した。PIK3CA遺伝子変異・増幅と臨床病理学的因子との相関はFisher’s exact test、予後との相関はKaplan-Meier法およびlog-rank testにより解析を行う。各因子の生存期間との相関性をCox比例ハザードモデルにより検討した。治療前の生検検体のパラフィンブロックからDNAを抽出し、腫瘍 組織DNAにおいてPIK3CA遺伝子変異および増幅をdirect sequencing法およびreal-time PCR法により検索した。また免疫染色によりAktなど下流蛋白のリン酸化を 調べ、PI3K/Aktシグナル経路の活性化や子宮頸癌細胞株を用い分子標的治療薬によるPI3K/Akt経路阻害を確認する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヒト子宮頸癌細胞6株においてPIK3CA遺伝子変異をエクソン9および20においてdirect sequencingにより解析したところ、2株で変異を認めた。次にシスプラチン毎週投与併用CCRTを施行した進行期IIB~IVA期の子宮頸癌患者59名において、治療前の生検腫瘍検体のパラフィンブロックからDNAを抽出し、同様にPIK3CA遺伝子変異を解析したところ、7名（12%）に変異を認めた。認めた変異は全てPIK3CA遺伝子がコードするp110α蛋白のヘリカルドメインまたはキナーゼドメイン内に位置していた。PIK3CA遺伝子変異の有無により臨床病理学的因子に有意な相違は認められなかった。変異の有無により癌特異的生存期間を比較したところ、正常症例は変異症例と比較して有意に予後良好であった。次に生存分析を行ったところ、PIK3CA遺伝子変異は全生存および癌特異的生存に関して、有意な予後不良因子であった。従って、分子標的薬によりPI3K/Aktシグナル経路をブロックすることにより、PIK3CA遺伝子変異を有する子宮頸癌においてCCRTの効果を増強し、予後を改善できる可能性が示唆された。

Strategy for Future Research Activity

腫瘍組織検体から薄切標本を作製し、免疫染色によりAktなどPI3K/Akt経路下流蛋白のリン酸化を調べ、シグナル経路の活性化について調べる。PIK3CA遺伝子変異を有する子宮頸癌細胞株Caskiを用い、分子標的薬によるPI3K/Akt経路の阻害による効果を調べる。標的分子が実際に阻害されているかをウェスタンブロットおよびRT-PCRにより、蛋白・RNAレベルで確認する。また以下の方法により各細胞機能への影響を評価する。MTTアッセイにより細胞増殖の変化を調べる。アポトーシスの検出のためTUNEL染色およびAnnexin Vアッセイを行う。細胞周期の評価のため、フローサイトメトリーを行い、アポトーシスおよびG1アレストの有無を評価する。細胞浸潤能を調べるため、ボイデンチャンバーを用いた浸潤アッセイを行う。

Causes of Carryover

研究の進行状況から、実験で使う物品の購入が予定より少なくなってしまったため次年度使用額が生じてしまった。
PI3K/Aktシグナル経路の阻害による効果を調べるためにウエスタンブロット、標的分子が実際に阻害されているかをウェスタンブロットおよびRT-PCRにより、蛋白・RNAレベルで確認する。また以下の方法により各細胞機能への影響を評価する。MTTアッセイにより細胞増殖の変化を調べる。アポトーシスの検出のためTUNEL染色およびAnnexin Vアッセイを行う。細胞周期の評価のため、フローサイトメトリーを行い、アポトーシスおよびG1アレストの有無を評価する。細胞浸潤能を調べるため、ボイデンチャンバーを用いた浸潤アッセイを行う。

Research Products

• [Journal Article] Prognostic significance of PIK3CA mutation in stage IIB to IVA cervical cancers treated by concurrent chemoradiotherapy with weekly cisplatin (2018)
  • Author(s): Bouchra Lachkar, Takeo Minaguchi, Azusa Akiyama, Shuling Liu, Shuang Zhang, Chenyang Xu, Ayumi Shikama, Nobutaka Tasaka, Manabu Sakurai, Sari Nakao, Hiroyuki Ochi, Hiroyuki Yoshikawa, Toyomi Satoh
  • Journal Title: Medicine Volume: 97 Pages: e11392
  • DOI: 10.1097
  • Peer Reviewed / Open Access