2018 Fiscal Year Research-status Report
胎児環境によるエピジェネティック変化を標的としたPCOS新規治療法の開発
| Project/Area Number |
17K16844
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
大須賀 智子 名古屋大学, 医学部附属病院, 講師 (30778296)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 多嚢胞性卵巣症候群 / メチル化変異 / 卵子メチル化 / モデル動物 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
妊娠16-19日齢のWister rat にアンドロゲン (DHT: dihydrotestosterone) またはvehicleを投与し、出生仔をPCOS モデルラットとコントロールラットとした。性周期の評価など、表現型の解析ののち、9-10 週齢に組織（視床下部、肝臓、膵臓、脂肪、卵巣）、血清の採取を行った。また、次世代への影響を評価するため、卵子を解析対象とし、卵子回収の効率性から、マウスモデルも同様に妊娠16-18日齢にDHTを投与することで作成した。視床下部、肝臓、卵子からゲノムDNA、mRNAの回収を行った。視床下部、肝臓から回収したゲノムDNA に対し、メチル化DNA濃縮法を用いてCpG領域のメチル化DNAを抽出、高速シーケンスを用いたメチル化部位のシーケンスを行った。卵子については、PBAT (Post-bisulfite adaptor-tagging) 法を用いた解析を行った。得られた結果はラット、マウスそれぞれのゲノム情報へのアライメントを行い、遺伝子領域の解析、Gene Ontology解析等を行った。卵子については、RNA seq.を用いた発現解析を行った。
モデルとコントロール間の比較で肝臓でのみ変化を示したものはCyp19a1、Esr2、視床下部でのみ変化を示したものはKiss1r、GnRH1、Leptin、肝臓・視床下部ともに変化がみられた遺伝子にFgf21、Igf1rが認められた。Gene Ontology解析では、肝臓では代謝プロセスに関連するクラスター、視床下部では神経伝達物質に関連するクラスターの低メチル化、卵子では着床に関するクラスターの発現低下等が検出された。視床下部・肝臓のメチル化解析と、卵子のメチル化解析の比較では、低メチル化では13遺伝子、高メチル化では6遺伝子が共通しており、F1からF2へのメチル化変化の継代が示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
モデル動物を用いた網羅的なメチル化解析により、治療標的となる分子の候補が選出されているが、定量PCRを用いた発現解析では、結果が限定的であったため、モデルラットの視床下部・肝臓のRNA seq.による解析に変更した。現在、low dataは得られており、ドライ解析を行っている。当初の予定では、患者検体を用いた解析を行う時期であるが、患者検体は貴重であるため、RNA seq.の結果を踏まえたのち、患者検体での解析を行う予定としている。
一方で、これまでに得られた結果や、モデルの作成方法から、メチル化変異の継代についての解析が有用と判断し、解析対象に卵子を追加したため、マウスモデルの作成などに時間を要することとなった。結果、マウスモデルの作成と卵子からのDNA、RNAの回収・解析に成功し、体細胞組織と卵子に共通のメチル化変異や世代間で共通するメチル化変異の検出など、興味深い結果を得るに至った。また、卵子のDNAメチル化変異とRNA seq.の結果については、Chip-Atlasを用いた検討を行い、転写因子によって制御される変動遺伝子とメチル化領域が検出され、PCOSの卵子に変化をきたす制御パスウェイの存在が示唆されている。
ラットモデルの視床下部と肝臓の検体について、RNA seq.による解析を進行中であり、これらの結果を統合し、より、複数の病態に関連する治療ターゲットを検出、最終年度では、in vivo、ex vivoによる治療法の検討、さらには、ヒト検体を用いた検討を予定している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、メチル化解析とRNA seq.から得られた結果をもとに、モデルラットを用いて、新規標的に対する治療法の検討を行う。治療法としては、エピジェネティック変化により発現亢進を来している因子の阻害剤や、DNA メチル化剤の投与、発現低下を呈する因子についてはタンパクそのものの補充や脱メチル化剤の投与、下流因子の活性化などの治療法を検討する。複数の臓器でDNA メチル化変異に由来する遺伝子発現異常を認めた分子や、より上流で作用する因子に対する治療は、全身投与での検討を行う。治療効果の判定としては、新規治療の介入による、モデルラットのPCOS 表現型の変化を検討する。また、モデル動物における排卵誘発や、体外受精により、新規治療と排卵誘発を併用した場合の卵胞発育の変化や、受精能の評価を行う。
ヒトにおける効果を検討するため、ヒト由来細胞や組織を用いたin vitro での添加実験を行う。採卵時や手術時に得たPCOS 患者の顆粒膜細胞をもちいて、モデルラットで表現型の改善が確認された薬剤を中心に、添加実験を行う。TUNEL 染色やCaspase、annexin Vによるアポトースの検出や、インスリン投与時の細胞内へのグルコース移行、FSH (卵胞刺激ホルモン) やLH (黄体形成ホルモン) 併用後の性ステロイドホルモン分泌能について検討する。また、卵巣組織培養の技術を用い、ヒト卵巣や、モデル動物の卵巣のex vivoでの添加実験や、卵胞発育の評価などを予定する。
これらin vivoやex vivo、in vitro の実験に共通して効果を示した薬剤からPCOS の新規治療薬の開発を目指す。
|
