2017 Fiscal Year Research-status Report
Non-invasive diagnostic methods using digital PCR for childhood cancers
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17K17002
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
栗原 將 広島大学, 医歯薬保健学研究科(医), 助教 (40724894)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 小児腫瘍学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1990年から同意を得て保存しえた神経芽腫、肝芽腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫症例の外科的切除腫瘍および、術前と術後の血漿（血清）、骨髄、腹水、胸水が保存されている症例100例を対象に以下の検討を行った。
1.遺伝子変異スクリーニング：既に遺伝子異常が判明している腫瘍の腫瘍由来のDNAと診断時血漿（血清）由来遊離DNA(cfDNA)を用いて次世代シークエンサー（Cancer Panel等）にて遺伝子異常をスクリーニングし、デジタルPCRで血漿cfDNAとmiRNAの測定を行った。その結果、遺伝子変異はほぼ100％検出できたが、miRNA発現は相関は少なかった。2.MYCN遺伝子増幅：MYCN遺伝子増幅は、腫瘍DNAに比べ、血漿cfDNAのデジタルPCRでの増幅率はかえって高く、腫瘍細胞自体のコピー数を反映していると考えられた。3.遺伝子異常検索： 血漿由来cfDNAを用いて神経芽腫でのALK変異について、デジタルPCRでの検出について検討する。さらに、肝芽腫で高頻度に見られるβ―カテニン異常のうちエクソン3の変異のある症例の血漿（血清）cfDNAを用いた2プローブデジタルPCR法でその検出率を検討し、腫瘍細胞から得られた欠失、変異のデータと照合したとこで、前者は95％、後者は98％の一致率であった。4.キメラ遺伝子検索： 横紋筋肉腫、ユーイング肉腫症例で、腫瘍からキメラ遺伝子が検出されている症例において、腫瘍キメラ遺伝子の部位から、特異的なPCRプライマーとプローブを設計し、血漿（血清）、胸水などの体液由来cfDNAをデジタルPCRを用いて検索し、検出可能な条件を検討した。5.遊離RNA（ｃｆRNA）の検索： 体液特に血液中のｃｆRNAやエクソソーム由来RNA を用いて、腫瘍特異性が示唆されているキメラ遺伝子の定量をデジタルPCRを用いて試みる系の策定行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1.遺伝子変異スクリーニング：既に遺伝子異常が判明している腫瘍の腫瘍由来のDNAと診断時血漿（血清）由来遊離DNA(cfDNA)を用いた次世代シークエンサー（Cancer Panel等）にて遺伝子異常をスクリーニングとデジタルPCRでの検証は順調であったが、miRNA発現が腫瘍と血漿中のものに相関が少なかった以外は順調であった。
2.MYCN遺伝子増幅：MYCN遺伝子増幅は、腫瘍DNAに比べ、血漿cfDNAのデジタルPCRでの増幅率はかえって高く、予想と相違した結果でありその有用性が示唆された
3.遺伝子異常検索： 血漿由来cfDNAを用いて神経芽腫でのALK変異について、デジタルPCRでの検出、肝芽腫で高頻度に見られるβ―カテニン異常のうちエクソン3の変異のある症例の血漿（血清）cfDNAを用いた2プローブデジタルPCR法でその検出は順調であった。
4.キメラ遺伝子検索： 横紋筋肉腫、ユーイング肉腫腫瘍のキメラ遺伝子が検出されている症例において、腫瘍キメラ遺伝子の部位から、特異的なPCRプライマーとプローブを設計し、血漿（血清）、胸水などの体液由来cfDNAをデジタルPCRを用いて検索し、検出可能な条件を検討中であり、ほぼ順調である
5.遊離RNA（cfRNA）の検索： 体液特に血液中のcfRNAやエクソソーム由来RNA を用いて、腫瘍特異性が示唆されているキメラ遺伝子の発現定量をデジタルPCRを用いて試みる系の策定行ったが未だに確立できていないが、来年度への向けての課題の抽出はできている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度の予定で繰り越したcFRNAの検出系の確立により腫瘍特異性が示唆されているキメラ遺伝子の発現定量を行う。
さらに、平成30年度は診断時の検体に加えて、治療中経過中の検体および骨髄、さらに胸水、腹水由来の血漿中のcfDNA を用いて、デジタルPCR による伝子増幅や変異、キメラ遺伝子の検出を検討し、治療効果判定あるいは再発指標としての有用性を以下のごとく検討する。
1.MYCN遺伝子増幅： MYCN増幅神経芽腫症例の術後に継時的に保存された血漿（血清）、骨髄cfDNAを用いて、デジタルPCR法によるMYCN増幅検出による骨髄転移の評価、化学療法・手術の治療効果、さらに再発予測の指標ととしての有効性を検証する。
2.遺伝子異常検索：ALK変異のある神経芽腫およびβ―カテニン異常（エクソン3の欠失または変異）が2プローブデジタルPCR法で検出できた肝芽腫の治療中や術後の血漿cfDNAを用いて、術後の治療効果、化学療法の有効性、さらに再発予測の指標としての有効性を検証する。
3.小円形細胞腫瘍のキメラ遺伝子検索：腫瘍及び血液由来cfDNAを用いて次世代シークエンサーにて、キメラ遺伝子が認められる遺伝子を中心に選択したライブラリーを作成し、キメラ遺伝子の存在部位を確定する。確定できたキメラ遺伝子については、個々にプライマーとプローブを設定し、術前、術後検体でデジタルＰＣＲを用いて、診断とともに、術後の治療効果、化学療法の有効性、さらに再発例においての再発予測の指標としての有効性を検証する。
4.microRNA検索：腫瘍特異性が示唆されているmicroRNAについて、体液特に血液中のエクソソームを濃縮し、それらからmicroRNA 抽出しをデジタルPCRを用いてmiRNA検出し、術前診断と術後経過について検討を加える。さらに、cfRNAの検出法の確立を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
平成29年度は、デジタルPCR法を用いて、miRNAやcfRNAの検出を試みるよていであったが、デジタルPCR用の検出機器に検出限界があり、その機器の調整に時間を要したため、平成30年度の検討に繰り越した。そのために、これらのpライマーやプローブ、試薬などの研究費の執行が平成30年度となっている。cfDNAの検索は順調にすすんでおり、平成30年度中にはmiRNAやcfRNAの検討も機器の調整後順調に進む予定である。
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Research Products
(7 results)
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[Presentation] Surgical and Interventional Treatment for ruptured hepatic Tumors in Japanese Study Group Experience2017
Author(s)
15.Hiyama E, Hishiki T, Hoshino K, Yokoi A, Tamata T, Kazama T, Honda S, Taguchi T, Kurihara S, Kawashima M, Ueda Y
Organizer
The 49th Congress of the International Society of Paediatric Oncology (SIOP2017)
Int'l Joint Research
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