2017 Fiscal Year Research-status Report
プロテオームとミネラロームを統合した石灰化解析イメージング法の開発
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17K17081
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
逸見 晶子 東北大学, 歯学研究科, 大学院非常勤講師 (40613055)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 石灰化 / SEM-EDX / 骨 / 軟骨 / 象牙質 / 免疫染色 / 質量顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者等のこれまでの研究は、硬組織の発生成長や修復の過程で、基質を構成するタンパクがミネラルと相互作用し、石灰化を進行させる可能性を示してきた。基質の多様なタンパク構成（プロテオーム）とミネラル構成（ミネラローム）が同時に可視化できれば、両者の相互作用と石灰化の理解は深まるが、その研究技術は現在まで得られていない。本研究計画は、タンパクーミネラル相互作用を解析する研究基盤として、プロテオームを可視化する質量分析イメージング法とミネラロームを可視化するエネルギー分散型X線分析（SEM-EDX）イメージング法を統合し、両者を同時に可視化する石灰化解析イメージング法を開発することを目的とした。
平成２９年度では、軟骨内骨化における軟骨の石灰化を対象として、ミネラロームを検討するために、生後２週齢ラットの下肢を4%パラホルムアルデヒドで固定し、非脱灰でパラフィン包埋して試料として利用した。切片をミネラルの構成元素であるカルシウムとリンおよび有機質の構成元素である炭素の基質における分布と濃度についてSEM-EDXを利用して解析した。また、基質のタンパクの分布については、抗II型コラーゲン抗体と抗X型コラーゲン抗体を用いた蛍光抗体法による免疫染色で検討し、SEM-EDXおよび蛍光抗体法の実験条件を確立した。平成３０年度では、同一切片にSEM-EDXと免疫染色を施して、ミネラルとコラーゲン分子を同時に可視化する技術を検討する。その上で、SEM-EDX解析と質量顕微鏡解析を同一切片で実施する方法論を検討する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
抗II型コラーゲン抗体の選定および同抗体による免疫染色条件の設定に予想以上の時間を要したため。また、SEM-EDX解析後の組織切片に免疫染色を施す実験条件の設定に時間を要しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成２９年に実施した予備実験においては、エネルギー分散型X線分析（SEM-EDX）でミネラルの集積を検討した組織切片では、同一切片で引き続き免疫染色を施した際、免疫染色性が低下する場合が多かった。平成３０年度では、SEM-EDX解析の際にコラーゲン分子の抗原性を保持し、同一切片に免疫染色を施してミネラルとコラーゲン分子を同時に可視化する至適な実験条件と技術を検討する。その上で、SEM-EDX解析と質量顕微鏡解析を同一切片で実施する方法論を検討する。
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