セロトニン受容体高発現iPS細胞を用いた睡眠時ブラキシズム治療薬開発への基盤研究

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K17187
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 松本 貴志 昭和大学, 歯学部, 助教 (00635039)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 5-HT2a / iPS

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、①効果的な5-HT2A高発現iPS細胞分化誘導法の確立、②5-HT2A高発現iPS細胞を用いたセロトニン受容体のSNP変異による受容体機能解析を礎とし、セロトニン受容体関連疾患治療薬を探索することを目的とする。
初年度にて、5-HT2a遺伝子上のSNP変異を保存したブラキシズム群およびコントロール群それぞれにおけるiPS細胞の樹立・樹立したiPS細胞より安定したセロトニン高発現神経細胞への分化誘導法について検討した。
当該年度では、効率的な5-HT2A 高発現細胞の選択的培養法の検討について実施した。
5-HT2A 高発現細胞を利用するため、生細胞での5-HT2A 発現レベルをモニタリングする方法が必要である。(ⅰ)標的遺伝子のプロモーター領域を応用した蛍光標識によるモニタリング法：5-HT2A のプロモーター領域を挿入したGFP標識ウイルスベクターを作製し、iPS細胞へ感染させる。蛍光顕微鏡により発光強度の高いコロニー群を選別し抽出する。(ⅱ)ソーティングによる分取法：神経へ分化誘導したiPS細胞を5-HT2A抗体により蛍光標識し、フローサイトメトリーを用いて選別・培養する。効率性および細胞への影響について、適切な選別培養方法についてこれら2つの方法について検討する。
5-HT2A遺伝子のプロモーター領域を挿入したVenus標識ウイルスベクターを作製、プロモーターベクターの作動性、特異性についての品質確認を実施し、適切なベクターの作動性および選択的な培養について可能となった。ソーティング法による分取法については、細胞状態への影響が大きいため、今後さらなる検討が必要である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当該年度研究予定であった研究については概ね順調に推移している。作製したウイルスベクターの作動性、正確性について検討し、良好な結果を得られた。今後は上記実験系による価格腫改正を実施する予定である。

Strategy for Future Research Activity

今後分子生物学的アプローチおよび神経生理学的アプローチによる、SNP変異による5-HT2aの作用の相違についての解析が必要となる。5-HT2A遺伝子のプロモーター領域を挿入したVenus標識ウイルスベクターによる分取法においては、他の神経細胞との隔離が困難であるが、培養プレート上での識別が可能であるため、主にパッチクランプ等神経生理学的検証を実施する。
フローサイトメトリーを利用したソーティングによる分取法は、目的細胞のみ効率よく分取可能であるため、主に分子生物学的解析を検証する予定である。しかし、ソーティング法は細胞への負担が大きく、適切な実験系の確立が今後検討が必要である。
上記検証より、SNP変異により影響のある事象を特定し、それに対する創薬開発へ向けたアプローチを推進する。

Causes of Carryover

当該年度においては、プロモーターベクターの作動性等に多くの時間を費やしており、その後の当該ベクターを使用した検証実験等については次年度での実施となるため、その際に必要となる汎用実験材料は実験試薬等に繰り越し分を利用する予定である。