2018 Fiscal Year Research-status Report
チタンインプラントの新生骨の再生を促進するためのインテリジェント界面の創出
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17K17204
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
陳 鵬 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 特任助教 (70708388)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | インテリジェント界面 / マイクロ・ナノ表面トポグラフィー / チタン / フェムト秒レーザー / ヒト間葉系幹細胞 / インプラント材 / バイオマテリアル / 医療・福祉 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
チタン（Ti）やTi合金は機械的性質並びに耐食性に優れていることから、インプラント材料として最も使用されている生体材料の一種である。しかしながら、Ti表面と新しい骨の形成や生体骨組織とを接合することが難しいという欠点があります。近年、Ti上への表面形貌の制御をして、Tiの生体細胞との親和性・適合性を向上させるために様々な研究が盛んに行われている。Ti上への周期的微細構造の形成には、レーザー表面加工が有効な手法の一つであると考えられる。本研究では、次世代向けインプラント、新生骨再生の促進をできるTi基インテリジェント界面の創出、特にヒト間葉系幹細胞・骨芽細胞の形態を制御がある、同時にインプラント材周辺の新生骨の再生を促進できる効果的に表面デザインの開発を目的とする。
本年度は、最適な骨形成を促進できる表面デザインを探索するために、Tiの表面にフェムト秒レーザーにより形成した等方性・異方性周期的微細構造ある表面パターンがヒト間葉系幹細胞の接着挙動および骨芽細胞への分化にどのような影響を評価に着手した。表面加工した微細構造より細胞接着の形態制御を確認するために、倒立型蛍光顕微鏡でTi表面上での細胞の伸展状態を観察し、Micron/nano（hybrid）の周期的な等方的な構造が最も優れた細胞接着斑の分布制御を示すことが明らかとなった。分化誘導培地を使用し、骨芽細胞への分化、軟骨細胞へ分化、脂肪細胞への分化など誘導した。各分化に関するバイオマーカーをリアルタイムRT-PCRで細胞遺伝子発現の測定および免疫蛍光染色で各分化関しているタンパク質発現の評価を可能とする測定系の構築を行い、現象の解明を進めている。さらに、マウスの前骨芽細胞（MC3T3-E1）の骨への分化促進について、チェックボード(checkboard)表面パターンが最も優れた硬組織適合性を示すことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度の研究結果に基づいて、本年度は、チタンインプランド材表面で最適な骨形成を促進できるデザインを探索した。周期的微細構造ある表面パターンよる細胞接着挙動の評価を可能とする測定系の構築を行い、金属基盤表面と幹細胞の相互作用を最適化することにより、生物活性を有するインプラント材の表面設計・開発を進めています。また、生体機能発現メカニズムに関しても、フェムト秒レーザー表面加工したTi表面微細構造による細胞の接着制御、hMSCsの骨芽細胞への分化促進、マウス骨芽細胞の新生骨組織の生成などを実証しており、研究は当初の計画通りに進展している。
さらに、本年度得られた結果が学術的に価値の高いものであることが認められたため、国内外の学会発表（８件、うち招待講演1件/うち国際学会4件）や論文投稿（４件）や外国特許（1件）を通じて成果の発信を行った。今年度の達成度は「おおむね順調に進展している」と自己評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、過去二年間の研究を継続し、Ti表面での周期的微細構造に接着発現機構の解明と一般的理論への拡張する予定であった。さらに最適な骨形成を促進できる表面デザインを探索し、金属基盤上での等方性・異方性周期的微細構造を持って表面パターンより幹細胞の接着や増殖や骨芽細胞への分化および新生骨組織の再生挙動などのメカニズムの解明の研究を継続することとする。得られた結果をさらに有効なレーザー表面加工技術・表面パターンデザインへとフィードバックする。具体的には、以下の項目に細分化された項目について、次年度に引き続き研究を継続する。
（１）周期的微細構造のスケール（マイクロメートルスケールまたはナノメートルスケール）と細胞接着で重要な役割を持つ接着斑（ビンキュリン）の分布制御および細胞内部での細胞骨格（アクチン フィラメント）のオリエンテーションの影響を明らかにする。また、引き続き接着のメカニズムの研究を継続する。
（２）最適な骨形成を促進できる表面デザインを獲得のために、Ti上で異方性周期的微細構造を持って表面パターンを検討する。Tiの上に間葉系幹細胞を分化誘導培地を使用しない、そのままに培養後にTotal RNAを抽出して、前年度決めましたバイオマーカーを使用し、細胞内の遺伝子発現の変動を測定結果による幹細胞の未分化維持や分化誘導において表面パターンの影響を調査に着手する。さらに、複数種類骨芽細胞（ヒトの骨芽細胞とマウスの骨芽細胞）を使用し、ALP活性と石灰化による骨再生関するタンパク質発現量解析による周期的微細構造を持って表面パターンが骨への分化制御・促進関する研究を行い、組織適合性獲得とその機構解明を行う。
これらの結果を基に、次年度の研究計画を策定する。また、研究の得られた成果は、国内外の学会における講演および学会誌への論文投稿により逐次公表する。
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| Causes of Carryover |
（理由）
次年度（令和元年度）は、本研究プロジェクトの最終年度になりました。ずっと使用されているヒト間葉系幹細胞ではなく、複数種類細胞（ヒトの骨芽細胞とマウスの骨芽細胞など）を使用し、フェムト秒レーザー照射よる周期的微細構造に細胞接着・分化機構の解明と一般的表面デザイン関する理論への拡張する予定であった。そのために、各細胞培養・解析用消耗品が大量購入を見送ったため。特に、値段が高い遺伝子分析関する消耗品の購入の予定であった。
（使用計画）
令和元年度の研究費には、当初の計画通りに実験を行うための消耗品の購入や、周辺研究の調査や研究成果の発表を目的とした国内外の学会参加旅費および登録費を計上する。さらに、令和元年度は、大量データ収集の効率化のため、複数種類細胞で評価を予定している。そのために、細胞の購入および細胞培養・遺伝子発現の解析に関する消耗品の購入する必要がある。また、国内外での学会発表のための参加登録費・旅費、および学術雑誌へ論文投稿する費用に充当する予定である。
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