2017 Fiscal Year Research-status Report

抜去歯由来細胞を用いたヒトに応用可能な歯・歯周組織ユニットの再生

Research Project

Project/Area Number	17K17223
Research Institution	The Nippon Dental University
Principal Investigator	豊村順子日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (80645630)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	歯の再生
Outline of Annual Research Achievements	生体内で、臨床で入手可能な細胞を使い、正常構造の歯周組織を含む「歯冠・歯根のユニット」の形成を可能にした。細胞は、ヒト歯髄細胞、ヒト歯根膜細胞とヒトマラッセ上皮遺残細胞またはブタマラッセ上皮遺残細胞を用い、これらの組み合わせで歯周組織を含む歯様のユニットの構造を確認した。しかし、再現性が乏しいという欠点がある。そこで再現性を高めるために、再度移植に用いる細胞の選定を行うことにした。歯髄細胞は象牙芽細胞に分化しやすい能力をもつ細胞を、マラッセ上皮遺残細胞はエナメル芽細胞に分化しやすい能力を持つ細胞の選定を行った。マラッセ上皮遺残細胞が多く、分離しやすいブタのマラッセ上皮遺残とヒト歯髄を使用した。歯髄細胞からの象牙芽細胞への分化誘導は、誘導培地やマラッセ上皮遺残細胞の培養上清あるいはインサートを用いてマラッセ上皮遺残細胞と非接触的に培養を行ったが、象牙芽細胞マーカーであるDSPPの発現は見られなかった。また、マラッセ上皮遺残細胞のエナメル芽細胞への分化誘導は、歯髄細胞の培養上清やインサートを用いて歯髄細胞と非接触的に培養を行った。コントロールとの間でAmelogeninやAmeloblastinの発現の差は見られたが、歯の発生の段階の発現とは異なった。培養細胞での各マーカーの発現が生体内での発現と同じように見られるのかわからないため、歯髄細胞とマラッセ上皮遺残細胞の相互作用が視覚的に確認できれば、そこから細胞の選定に必要な情報を得られるのではないかと考えた。そこで、コラーゲンと歯髄細胞を混合しクローニングシリンダーの中に入れ固め、その上にマラッセ上皮遺残細胞をのせ共培養し、歯髄細胞とマラッセ上皮遺残細胞の間で形態的変化がないか解析中である。また、歯と歯周組織の形成には上皮・間葉相互作用が必須であると思われるので、マラッセ上皮遺残-歯髄細胞の接着を密にする方法の検討を行っている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 象牙芽細胞に分化しやすい能力をもつ歯髄細胞の選定やエナメル芽細胞に分化しやすい能力を持つマラッセ上皮遺残細胞の選定に時間がかかっているため。また、マラッセ上皮遺残細胞と歯髄細胞を密に接着させる方法の開発に手間どっているため。
Strategy for Future Research Activity	象牙芽細胞に分化しやすい能力をもつ歯髄細胞やエナメル芽細胞に分化しやすい能力を持つマラッセ上皮遺残細胞の選定を引き続き行うが、各マーカーの発現などが生体内での発現と同じように見られるのかがわからないため、細胞の選定の確認方法を変更する。コラーゲンと歯髄細胞を混合した後、37℃で固め、その上にマラッセ上皮遺残細胞をのせ共培養し、歯髄細胞とマラッセ上皮遺残細胞の間で形態的変化がないか確認する。また、上皮と間葉を密に接着させるため基底膜の構成成分であるラミニンを使用することも検討する。次に、上記で形態変化が確認された細胞を使い、スキッドマウスの腹腔内に移植し、歯冠もしくは正常構造の歯周組織を含む歯のユニットの形成を行い、組織解析を行う。また、変化のない細胞も生体内に移植し、同様に組織解析を行う。正常構造の歯周組織を含む歯のユニットの形成には、歯髄細胞とマラッセ上皮遺残細胞に加え、歯根膜由来の細胞をシート化したものも使用する予定である。再現性のよい歯冠もしくは歯周組織を含む歯のユニットの形成を可能にできれば、どのように再生されているか経時変化を確認する。また、生体内に移植せずに、培養下で歯冠のみもしくは歯周組織を含む歯のユニットの形成を行う。
Causes of Carryover	(理由）今年度、実験予定だった動物実験における実験動物や動物実験における組織解析に必要な試薬などを購入する予定にしていたが、実験が次年度にのびたため次年度使額が生じた。 (使用計画) 動物実験における実験動物や動物実験における組織解析に必要な試薬の購入やin vitroでの実験における培養液関係の試薬、ピペットやシャーレなどの培養消耗器具の購入に使用する。