浮遊細胞を利用した脂肪幹細胞の高効率培養法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K17238
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 米永 一理 東京大学, 医学部附属病院, 届出診療員 (60756774)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ASC / 浮遊細胞 / 培養法

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、引き続き、ASC（脂肪幹細胞）の培養効率を飛躍的に向上させるため、ASCの培養において生じる浮遊細胞の有用性を検証している。まず、ASCの至適な細胞単離・抽出条件の検討をおこなった。具体的には、患者より採取された余剰脂肪組織を、5-10ｍｍ程度の大きさになるまで細切。その後様々な濃度のコラゲナーゼを準備し、遠心分離することで、脂肪組織からASCを単離。その際、各濃度における2、4、6、24時間後の全細胞、生細胞数、および細胞生存率を自動測定器NucleoCounter®で測定。これらから回収される細胞に対しRT-PCR法を行った。さらに、RT-PCRでは、p53、TNF-α、BCL-2, IL-1β、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseを測定。またアポトーシスを、一本鎖DNA ELISAキットにて測定。この結果より単離・抽出条件を決定しようとしている。次に、ASCの至適な細胞播種濃度検討を検討をしている。上記で単離されたASCの生細胞を、初代培養の最適な細胞播種密度を評価するため、間葉系幹細胞増殖培地を用いて、様々な細胞密度で播種した。これを1週間培養後細胞を回収し、最も収量の多い細胞播種密度がどの濃度であるか明らかにしてきている。さらにこの時各濃度においてどの程度浮遊細胞が発生しているかを培養24h後に測定。これにより、安定して確実に細胞を確保できる濃度を決定しようとしている。そして、浮遊細胞の発生メカニズムの解明をしている。培養24h毎に接着細胞と浮遊細胞を回収し、1週間に渡って、ASC分裂の細胞周期を、フローサイトメトリーを用いてDNA量分析にて行っている。このDNA 量ヒストグラムから細胞周期の各パラメータを取り出し、解析を行い浮遊細胞が発生するメカニズムを解明。これにより、効率的な浮遊細胞回収時期を決定しようとしている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

最終結果がでるまでにもう少し時間を要する見込みであるが、最終報告にむけ、同時並行で準備を始めている。

Strategy for Future Research Activity

引き続き、申請内容に則り研究を推進し、まとめる予定である

Causes of Carryover

（理由）
当初見込みより試薬等の消耗品のコストを抑えることができたため。
（使用計画）
次年度の研究加速のために充てる計画である。