2017 Fiscal Year Research-status Report
新規TMEM16Eモノクローナル抗体クローンの免疫組織化学用途へのバリデーション
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17K17253
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| Research Institution | Department of Clinical Research, National Hospital Organization Kure Medical Center |
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Principal Investigator |
久保薗 和美 独立行政法人国立病院機構(呉医療センター臨床研究部), 歯科・口腔外科, 歯科医師 (80750132)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | TMEM16E / ANO5 / LGMD2L / GDD / GDD1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
病理組織を用いた診断に免疫組織染色は大きな力を発揮するが、そのためには染色に用いる抗体のバリデーションは必須である。TMEM16Eは欠損あるいは機能喪失により肢帯型筋ジストロフィーの原因となり、機能獲得型変異により顎骨骨幹異形成症の原因となる。本研究では高い信頼度で内在性TMEM16Eタンパク分子を検出できる抗体の開発を目指している。申請者はラットを免疫動物として、リンパ節近傍へのTMEM16E発現ベクター導入によって抗原を発現免疫させるDNA免疫法を実施し、免疫動物より採取したリンパ球をラット骨髄腫由来細胞と融合したハイブリドーマを多数ストックし、各種抗体アプリケーションにおいて高感度検出能力を示すモノクローナル抗体産生クローンの同定を試みている。本研究ではTMEM16Eノックアウトマウス組織を絶対的な陰性対照として野生型マウスの骨格筋組織の免疫組織化学染色に高い抗体価を示すクローンの選択を第一の目的としている。本年度は既にポリクローナル抗体を用いた実験系が確立している培養筋管細胞において、ウエスタンブロット及び免疫細胞染色を用いて強く特異シグナルを検出できるハイブリドーマクローンを同定した。またマウス筋組織を用いたウエスタンブロットでも市販のどの抗体よりも強いシグナルを特異的に検出することが確認できた。現在までに組織染色において有効なTMEM16E抗体は存在していないので、固定法包埋法等マウス筋組織の免疫染色のプロトコルをこのハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を用いて確立したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本計画の単独申請者の所属機関が申請時のTMEM16Eを発見した国立大学研究室から別機関である国立病院機構に異動したため、遺伝子改変マウスを試料とした実験を再開できる体制を整えることに時間を費やした。TMEM16E遺伝子改変マウスはKOマウス同士での交配効率が低く本研究で最大の利点である絶対的陰性対照となる組織を効率的に得ることが不可能であることを申請者は危惧していた。国立大学研究室で継続する遺伝子改変マウス維持に縮小した飼育スケールから希望したタイミングでサンプル供与及び実験を連続的に実施することは困難であったが前所属研究室の協力を受け改善中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
選択された新規モノクローナルTMEM16E抗体を持いて、各種組織切片上におけるTMEM16Eの発現レベルを可視化したマウス全身のTMEM16E分布アトラスを作成する。また、各組織の細胞レベルでのミクロな細胞内局在を電子顕微鏡によっても可視化する。さらに本遺伝子の機能獲得型変異がもたらす顎骨骨幹異形成症GDDのモデルとなるGDD変異ノックインマウスのホモ型変異マウスを用いることでGDD変異型TMEM16Eの全身分布アトラスを作成し、発現組織の表現型の解析に発展させる。同時に新規に市販されるTMEM16E抗体のバリデーションも実施して目的の達成を目指す。
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| Causes of Carryover |
本計画の代表者である申請者が転勤でTMEM16Eを発見した研究室から離れたため、すぐに研究を再開できる体制を整えることが困難になり、研究が中断していたため。
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Research Products
(2 results)
