2017 Fiscal Year Research-status Report
GroEL発現乳酸菌を用いた経粘膜ワクチンデリバリー製剤の開発
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17K17296
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
濱野 美緒 (萩原美緒) 日本大学, 松戸歯学部, 助教 (60724820)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | GroEL / 乳酸菌 / 粘膜免疫 / 舌下免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
GroEL発現乳酸菌の作成：CRISPR-Cas9システムは、CAS９と複合体を形成したpre-crRNAは、リピート配列に対して相補的にtracrRNAと結合した後、RNAse IIIによる切断と幾つかのステップを経て短いcrRNAとなる。このcrRNAと相補的に結合した外来DNA鎖はCas9によって切断される。ゲノム編集においては、Cas9とともに、目的の箇所でゲノムを切断するように設計したcrRNAの３‘末端にtracrRNAを連結させたsingle-guide RNA(sgRNA)を用いた。Lactobacillus reuteriの標的部位を選択し、guideRNA発現配列を決定後、クローニングを行い、CRISPRベクターを構築した。人工遺伝子合成によりノックイン用のプラスミドベクターを構築GroEL遺伝子を挿入した。
CRISPR-Cas9遺伝子送達システムにより Lactobacillus reuteriの標的部位の２本鎖RNAを切断後、切断付近の相同配列を含むドナーDNA存在下で相同組み替えによりGroEL遺伝子のノックインを行う。GroELの発現効率は蛍光顕微鏡を用いてのイメージングやシークエンサー、リアルタイムPCRにより確認した。
rGroELと既存の粘膜免疫アジュバントの舌下免疫による抗原特異的免疫応答の測定:
①BALB/cマウスにrGroELを既存の粘膜免疫アジュバントと共に舌下免疫を行う。適切な抗原投与量、投与回数はこれまでの実験結果を参考にし、予備実験を行って決定。②免疫後の体重変化、下痢、炎症の有無、ワクチンの安全性について検討。③舌下免疫後は、マウスから唾液、鼻腔洗浄液、血清を採取しGroEL特異的IgG, IgA抗体価の経時的変化をELISA法にて測定。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GroEL発現乳酸菌の作成の段階：CRISPR-Cas9遺伝子送達システムにより Lactobacillus reuteriの標的部位の２本鎖RNAを切断後、切断付近の相同配列を含むドナーDNA存在下で相同組み替えによりGroEL遺伝子のノックインを行うところまで進んでいるので。
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| Strategy for Future Research Activity |
GroELを発現させた乳酸菌の舌下免疫による抗原特異的免疫応答の測定：
①BALB/cマウスにGroELを発現させた乳酸菌を用いて舌下免疫を行う。適切な菌体投与量、投与回数はこれまでの実験結果を参考にし、予備実験を行って決定する。②免疫後の体重変化、下痢、炎症の有無、ワクチンの安全性について検討する。③舌下免疫後は、マウスから唾液、鼻腔洗浄液、血清を採取しGroEL特異的IgG, IgA抗体価の経時的的変化をELISA法にて測定する。抗体価については免疫後12か月までの長期間について測定する。④マウスの脾臓、唾液腺、及び頸部リンパ節よりリンパ球を分離し、GroEL特異的IgG, IgA抗体産生細胞数をELISPOT法にて測定する。⑤GroEL特異的ヘルパーT細胞応答を測定するために、免疫したマウスの脾臓及び頸部リンパ節リンパ球からCD4陽性T細胞を分離して、細胞増殖活性および細胞内染色によるフローサイトメトリー解析によりエフェクターT細胞（Th1, Th2, Th17, Treg）を中心としたサイトカイン産生応答について解析を加える。
⑥抗原の舌下投与後、樹状細胞の動態（細胞サブセット、ケモカイン、ケモカインレセプターの発現など）について、免疫組織染色（共焦点顕微鏡、現有設備）、フローサイトメトリー、ケモタキシスアッセイシステムにより、樹状細胞の遊走、活性化の機序を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
研究手法に修正が必要になり，予備実験で使用する材料やマウス等の消耗品費を使用せずに次年度に繰り越した。ELISPOTやフローサイトで使用する材料もまとめて次年度に購入する。
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