2017 Fiscal Year Research-status Report
ヒトiPS細胞を用いた高効率なエナメル芽細胞分化誘導法の確立
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17K17310
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
新垣 真紀子 東北大学, 歯学研究科, 助教 (80610675)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヒトiPS細胞 / エナメル芽細胞 / 歯 / 再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、将来的な歯の再生医療（人工歯胚再生）に応用可能な細胞ソースとして、ヒトiPS細胞から歯原性上皮細胞もしくはエナメル芽細胞への高効率な分化誘導法の開発を行ない、さらにそこで得られたヒトiPS細胞由来エナメル芽細胞を用い、エナメル芽細胞の詳細な分化メカニズムを解明することを目的とする。我々の研究グループはすでに、歯原性上皮細胞からエナメル芽細胞への分化には、エナメル芽細胞が分泌するエナメル基質アメロブラスチン（Ambn）や神経栄養因子であるNT-4が重要な役割をもつことを明らかにしており、マウスiPS細胞をAmbn遺伝子を発現するラット歯原性上皮細胞株（SF2）と共培養または培養上清を用いて培養することにより、エナメル芽細胞に分化誘導することに成功している。
平成29年度はヒトiPS細胞をフィーダーフリー培養に移行して多分化能を維持しながら、SF2細胞の培養上清を用いて歯原性上皮細胞もしくはエナメル芽細胞へと分化誘導を行った。これによって他の細胞および動物由来成分の混入を最小限に抑えることが可能であったが、分化誘導した細胞は形態的にも間葉細胞様のものが多く、現在RT-PCR解析を用いてiPS細胞の未分化・多能性マーカー遺伝子および歯原性細胞のマーカー遺伝子の発現を確認するとともに、エナメル芽細胞への分化誘導効率について検討を行っている。
また、エナメル芽細胞への分化誘導因子の１つとして神経栄養因子であるNT-4に着目しており、NT-4の歯原性上皮細胞SF2における機能解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度は、計画ではヒトiPS細胞をフィーダーフリー、Xenoフリー培養に移行して、SF2細胞の培養上清を用いて歯原性上皮細胞への分化誘導を行うことで、他の細胞および他の動物成分の混入を最小限に抑え、分化誘導効率を上げるための培養方法を検討することを目的としていた。現段階ではオンフィーダーの時に比較し、フィーダーフリーおよび浮遊培養では上皮前駆細胞への分化効率が低く、そのため歯原性上皮細胞への分化誘導効率が低下している。今年度も引き続きヒト由来iPS細胞の培養方法と歯原性上皮細胞への分化誘導効率を検討する必要がある。
また現在、H30年度に行う予定であった、エナメル芽細胞への分化誘導因子の同定として、神経栄養因子であるNT-4に着目し、歯原性上皮細胞SF2においてNT-4が担う機能の解析を行っている。よってヒトiPS細胞の培養方法の検討とエナメル芽細胞への分化誘導因子の同定を並行して進めることができたことより進捗状況としてはおおむね順調に進展しているとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度はヒトiPS細胞のエナメル芽細胞への分化効率の検討を行う。iPS細胞は多分化能を有するため、上皮前駆細胞へ分化制御することにより、歯原性上皮細胞あるいはエナメル芽細胞への高効率な分化誘導が期待される。研究計画としては、ヒトiPS細胞の凝集塊をK-SFMで培養し、さらにBMP4コンパウンドを添加し培養することでp63およびCK14陽性の上皮前駆細胞へと誘導を試みる。
また、エナメル芽細胞への分化誘導因子の同定として、現在行っているNT-4の前駆体proNT-4の受容体であるp75NTRタンパクのSF2細胞における機能解析を行うとともに、SF2の培養上清に含まれる他の誘導因子を探索する。限外ろ過法や超遠心分析にて培養上清に含まれるタンパク質を分離・精製し、分化に関わると推測される因子のさらなる同定を行う。
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| Causes of Carryover |
当該年度に予定していた学会参加と研究成果発表がなくなったため、主に旅費として計上していた分に余りが出たため、次年度使用額が生じた。次年度は国際学会への参加も予定しており、また、当該年度の研究成果を活かして、ヒト由来iPS細胞から分化誘導したヒト歯原性上皮細胞の解析を進める予定である。具体的には、マイクロアレイ解析やそれにより同定された因子の強制発現やsiRNAノックダウン法により機能解析を行なう予定である。
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