RANKL結合ペプチドによる骨造成法の口蓋裂治療応用における基礎的研究基盤の構築

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K17314
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 上原 智己 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (50783130)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 口唇口蓋裂 / ペプチド / 骨造成 / 長期経過 / 注射

Outline of Annual Research Achievements

口唇口蓋裂に対する顎裂部の骨欠損を補填する治療では、侵襲性を少なくする方法が必要とされている。近年我々は、BMP-2とRANKL結合ペプチドの併用による、新規骨造成法を開発した。この技術を応用し、注射によって骨を造成する、外科的侵襲の少ない治療法の基礎的研究基盤の確立を目指している。実際の口蓋裂治療への臨床応用に際し、新生した骨の長期的な維持の可否を検証する必要がある。しかし、これまでにRANKL結合ペプチドにより新生された骨の長期的観察はされておらず、骨を新生しても機能させなければ吸収されることが予想される。そこで本研究では、新生骨にメカニカルストレスを負荷することにより、長期間維持されるかどうか否かを検討する。
当初はマウスの上顎の切歯と第一臼歯の間の歯隙に骨を新生させ、矯正力により第一臼歯をその新生骨部に誘導する、「矯正モデル」を用いた新生骨の経時的変化を観察する計画を立てた。しかし、新生骨の位置や大きさを正確にコントロールすることは困難であり、矯正力により得られる150µm程度の歯牙の移動量では、新生骨部に歯を誘導し、矯正力を負荷させるモデルとして不十分であった。
よって、別のモデルを確立する、または、注射法を改良する必要があった。別のモデルとしては、マウス臼歯に糸を結紮することで歯周炎を引き起こし、得られた吸収窩に新生骨を造成する「歯槽骨吸収モデル」を立ち上げたが、新生骨が形成されるまでの28日間の間に、吸収窩が自然治癒してしまい良好な結果は得られなかった。
一方、注射法は改良でき、新生骨の位置や大きさをコントロールすることが可能となった。そこで、上顎の切歯と第一臼歯の間の歯隙に骨を新生させ、当該部にチタン製のスクリューの埋入を行うことにした。新生骨にスクリューの保持というメカニカルストレスを与え機能させることで、新生骨を長期間保持することが可能か否かを明らかにする。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

矯正モデルでは、マウス歯牙への矯正力の負荷により得られる歯の移動量が150µm程度であったことで、新生骨部へ正確に歯を誘導することが困難であった。
その後に取り掛かった歯槽骨吸収モデルでは、マウスの上顎第二臼歯の歯頸部に糸を結紮し、歯周炎を引き起こすことにより吸収窩をつくり、当部に新生骨を造成することを試みた。2週間の結紮で十分な吸収窩が得られたため、その後の治癒過程について解析したところ、結紮除去後2週間の時点で吸収窩の自然治癒が生じていることが確認された。新生骨が形成されるまでは約28日を要するため、自然治癒によって生じた骨と、注射によってできた新生骨かどうかの判断が難しいことが推察された。
また、薬剤を投与するための注射法に関しても多くの試行、考案が必要であった。本研究における注射では、薬剤の投与量を正確に計測するためにハミルトンシリンジを用いている。だが、ハミルトンシリンジでは本実験で用いるゲル状の物質を吸引することができなかったため、粘調度の高い物質でも吸引することができるピペットを新たに使用し、ハミルトンシリンジ後部より薬剤を注入後注射することとした。このような新たな注射法の確立にも時間を要した。さらに、薬剤の注入量を当初よりも減らすことで新生骨の部位や形態にある程度の再現性を持たせることが可能となった。
現在は改良した注射法を用いて新生骨を造成し、当該部にチタン製のスクリューの埋入を行っている。今後は、新生骨にスクリューの保持というメカニカルストレスを与え機能させることで、新生骨を長期間維持することが可能か否かを明らかにする。これまでに行った予備実験では、スクリューの埋入により骨形成が促進することや、骨石灰化期間が延長することが示唆された。これらの解析を次年度に行う予定であるため、やや遅れているとした。

Strategy for Future Research Activity

マウスの上顎の切歯と第一臼歯の間の歯隙に骨を新生させ、当該部にチタン製のスクリューを埋入する。スクリューを保持する新生骨と、保持しない新生骨で長期維持に差が生じるか否かについて検討を行う。
今後は、in vivo µCTを使用して経時的な三次元X線画像を撮影、安楽死後に組織を摘出し、軟X線画像撮影や、凍結切片を用いた各種染色を行うことで、さらなる詳細を検討する予定である。

Causes of Carryover

使用モデルの変更や新規立ち上げにより、実験の進行が遅延した。伴い、解析に必要な機器、器材の購入を次年度に持ち越したため、繰り越し金が生じた。また、解析ソフト購入や論文投稿のための英文校正費、学会発表に関する旅費等も計上する予定である。