Investigation of the homeostasis retaining mechanism with autophagy in orthodontic tooth movement.

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K17324
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 中村 政裕 岡山大学, 大学病院, 助教 (20708036)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 実験的歯牙移動 / オートファジー / 細胞内恒常性維持機構

Outline of Annual Research Achievements

歯に矯正力を加えると周囲歯槽骨の骨代謝が亢進し歯牙移動が可能となる。その際、骨基質表層の骨芽細胞では、基質タンパク質合成が亢進するだけでなく、メカニカルストレスや低酸素、酸化ストレスなど様々な病的環境に曝され、細胞の恒常性は低下していると推測されるが、その詳細な分子メカニズムは未だ不明な点が多い。本研究の目的は、種々の細胞内で不要物質を分解し、細胞機能を維持する機構として知られているオートファジーに着目し、矯正的歯牙移動時の骨芽細胞におけるオートファジーを介した恒常性維持機構を遺伝子改変マウスを用いて明らかにすることである。
本研究では、歯牙移動時の骨芽細胞における細胞内恒常性維持メカニズムの解明を目的に、遺伝子改変マウスを用いオートファジーの発現動態および機能解析を行う。まずLC3-GFPトランスジェニックマウスを用い実験的歯牙移動を行い、オートファジーの時間的・部位的分布を免疫組織化学的観察および定量的解析にて明らかにする。さらに 骨、軟骨組織特異的にオートファジーをノックアウトしたCre発現依存的遺伝子欠損マウスを用い、microCTによる歯牙移動量の変化やそれに伴う周囲組織の変化を免疫染色、In situ ハイブリダイゼーション法にて観察する。
現在、LC3-GFPトランスジェニックマウスの系統維持が困難であったため、C57BL/6マウスに対し、実験的歯牙移動を行い、LC3およびATG5の免疫組織化学的観察にてオートファジーの発現を確認している。また、すでに骨、軟骨組織特異的にオートファジーをノックアウトしたTwist2-cre;ATG5 flox/floxマウスの作出が完了している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度にはLC3-GFPトランスジェニックマウスにて歯牙移動時のオートファジー発現を時間的部位的分布を確認する予定であったが、LC3-GFPトランスジェニックマウスの系統維持が困難となったため、C57BL/6マウスに対し、実験的歯牙移動を行い、LC3およびATG5の免疫組織化学的観察にてオートファジーの発現を確認している。

Strategy for Future Research Activity

Twist2-cre;ATG5 flox/floxマウスの作出を継続するが、動物実験舎の移転に伴い胚移植が必要となっている。早期に胚を作成し、移植を試みる必要がある。マウス胚作成と平行し、マウスカルバリアより骨芽細胞を単離、培養し、サブコンフレントに達した際に培養細胞伸展装置FX-3000TM-Flexercell Strain Unit(Flexarcell International Corporation, Hillsborough, NC)を使用し、伸展圧迫ストレス下で培養する。さらに、5％低酸素および過酸化水素水を加え、低酸素、酸化ストレス下で培養する。培養細胞からRNAを回収し、mRNA発現量の違いをreal-time PCRにて解析する。