2017 Fiscal Year Research-status Report
歯の発生における上皮間葉相互作用でのCa2+応答の役割とエナメル芽細胞の分化
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17K17337
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
村田 佳織 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (70781053)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | カルシウム応答 / イメージング / 歯原性上皮 / SOCE / マイグレーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では歯の発生過程における細胞内カルシウム応答とその関連遺伝子発現を可視化し、カルシウム応答と遺伝子発現の関連を明らかにすること、及び遺伝子発現の調節におけるカルシウム応答の役割を明らかにすることを目的とする。ラット歯原性上皮細胞(SF2)とヒト歯髄幹細胞（DPSC）を用いてライブセルイメージング観察を行った。
これまでにSF2細胞とDPSCのそれぞれにレンチウイルスベクターを用いることでカルシウムセンサー安定発現細胞の作成に成功している。これにより長時間ライブセルイメージング観察が可能となり、SF2細胞の自発的で間欠的なカルシウム応答を発見した。これらの細胞内カルシウム濃度の上昇はストア作動性カルシウム流入（SOCE）の阻害剤であるLaCl3によって減少した。全反射顕微鏡による観察では、LaCl3は血清存在下における細胞のマイグレーションの抑制をしたことから血清存在下におけるマイグレーションにSOCEを介するカルシウム流入が関与することが明らかとなった。これらのことからSOCEは歯原性上皮細胞の形態形成において細胞のマイグレーションを制御している可能性があること示唆された。
歯の発生過程におけるカルシウム応答の役割を観察するために、SF2細胞とDPSCの共培養条件下での観察を行った。共培養条件下ではSF2細胞のカルシウム応答が増加する傾向が認められた。また、LaCl3の添加により、細胞内カルシウム濃度の低下とマイグレーションの抑制が認められた。次に共培養により変化する遺伝子を調べるために次世代シーケンサーにより網羅的解析を行なった。共培養によりTGF-b関連遺伝子の発現増加が認められた。またSOCEの阻害により抑制される遺伝子も認められた。(研究協力者：蓑輪映里佳)
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
血清存在下におけるマイグレーションとカルシウム応答の関連を明らかにするために、定量的な解析を行い、血清存在下ではマイグレーションが大きく、SOCEの阻害によりマイグレーションが抑制されることが明らかとなった。
共培養条件下におけるカルシウム応答の観察では、共培養によりSF2細胞のカルシウム応答の頻度の増加傾向が観察された。カルシウム応答と遺伝子発現の関連を明らかにするために、次世代シーケンサーを用いた網羅的な解析による遺伝子発現の変化を観察し、多数の遺伝子が共培養により変化している可能性が示唆された。またSOCEの阻害により影響を受ける遺伝子が認められた。発現量の変化の大きかった遺伝子についてさらにRT-PCR法やリアルタイムPCR法などで解析を行っている。またカルシウムイメージングと遺伝子発現の同時解析を計画しており、現在それに適した遺伝子は検討中である。今後は遺伝子発現の経時的な変化の観察を行うことにより、適した遺伝子を決定する。
また、遺伝子発現とカルシウム応答の直接的な関連については、アメロジェニンの発光プロモーターアッセイセンサーを改変し、目的遺伝子の蛍光のプロモーターアッセイセンサーの作成を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
マイグレーションとカルシウム応答の関連を明らかにするために、血清中のどのような因子がマイグレーションに関与し、カルシウム応答により影響を受けるのかを明らかにするために、Oris cell migration assay法にて無血清培地に含まれるEGFやFGFの添加や、SOCEの阻害剤を用いて、マイグレーションに対する影響を解析する。
ライブセルイメージング観察で認められたマイグレーションの変化について、移動距離などを計測し、SOCE阻害時における移動距離の変化量の比較や、マイグレーションのパターンなどの定量化を試みる。移動距離とカルシウム応答の変化の解析には適したソフトを検討中である。
RT-PCR法やリアルタイムPCR法などにより定量的に共培養条件下における経時的な遺伝子発現の変化を観察し、発現パターンを解析する。カルシウム応答の抑制により変化が著しい遺伝子に関してはプロモーターアッセイセンサーを作成して、カルシウム応答と遺伝子発現の関連を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
研究の進捗状況がやや遅れているため、使用額が予定よりもやや少なかったため。
研究方法の改善を行い、研究が計画通り進むよう計画を立て直す。次年度使用額は培養液などの購入に充てることを計画している。
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