2018 Fiscal Year Research-status Report
歯の発生における上皮間葉相互作用でのCa2+応答の役割とエナメル芽細胞の分化
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17K17337
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| Research Institution | Health Sciences University of Hokkaido |
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Principal Investigator |
村田 佳織 北海道医療大学, 歯学部, 助教 (70781053)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | カルシウム応答 / 歯原性上皮細胞 / マイグレーション / SOCE |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、歯の発生過程における細胞内カルシウム応答とその関連遺伝子を可視化し、カルシウム応答と遺伝子発現の関連を明らかにすること、及び遺伝子発現の調節におけるカルシウム応答の役割を明らかにすることを目的とする。細胞はラット歯原性上皮細胞（SF2）とヒト歯髄幹細胞（DPSC）を用いて実験を行う。
SF2細胞とDPSCのそれぞれに異なる蛍光を発するカルシウムセンサーをレンチウイルスベクターを用いて発現させ、長時間ライブセルイメージング観察を行うことにより、SF2細胞の自発的で間歇的なカルシウム応答や、SF2細胞とは異なったDPSCのカルシウム応答を観察してきた。SF2細胞のカルシウム応答はSOCEの阻害剤であるLaCl3の添加により減少することが明らかとなっており、マイグレーションを抑制することが明らかとなった。このことから、SOCEは歯原性上皮細胞のマイグレーションを制御し、歯の形態形成に関与している可能性が示唆された。マイグレーションとSOCEの関連を調べるために、定量的なマイグレーションアッセイを行い、SOCE阻害剤でマイグレーションが有意に抑制されることが明らかとなった。また、血清の存在によりマイグレーションが促進されることから、マイグレーションに関与する因子の同定を行なった。無血清培地に含まれるEGFやFGF、B27の関与の検討や、マイグレーションに関与するとの報告があるケモカイン（CXCL12）の影響を検討した。
SF2細胞とDPSCの共培養条件下におけるカルシウム応答の観察では、共培養することによりSF2細胞のカルシウム応答が増加し、遺伝子発現の変化では発現が大きく変化した遺伝子が多数あった。SOCEの阻害剤の添加により、遺伝子発現が変化するものもあり、RT-PCR法などで検討しており、遺伝子発現の変化にはいくつかのパターンがあることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
血清の存在下においてマイグレーションが促進されるメカニズムについて明らかにするために、定量的な解析を行い、SOCEの阻害剤によって抑制されることが明らかとなっているが、今年度はマイグレーションを促進する因子の同定を行なった。EGFやCXCL12といったマイグレーションに関連すると報告されている因子でのマイグレーションの変化を解析し、EGFとCXCL12の共添加により、血清と同等のマイグレーションを起こすことを明らかにした。また、これはSOCEの阻害剤では抑制されないことが明らかとなった。さらに、FGFや、FGFとCXCL12の共添加も試みたが、FGFはマイグレーションに影響をしないことが示唆された。
カルシウム応答と遺伝子発現の関連については、次世代シーケンサーで発現量に大きく変化の見られた遺伝子についてRT-PCR法などで解析を行なっているが、再現性が乏しく難航している。遺伝子発現とカルシウム応答の同時観察を行うことを目標としているが、遺伝子が決定次第、センサーの開発が行えるよう準備をしている。
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| Strategy for Future Research Activity |
無血清培地に使用するB27でマイグレーションが促進される傾向があることが明らかになったため、B27の成分の一つであるインスリンが関与している可能性があるため、インスリンを用いてマイグレーションに対する影響を解析する。また、インスリンの阻害剤を用いて、マイグレーションへが変化するかについても解析を行う。
カルシウム応答と遺伝子発現の関連に関する研究では、歯の発生に関与してるとの報告があるレチノイン酸が次世代シーケンサーで発現量に大きく変化があったため、RT-PCR法などで発現量の解析を行い、実際に発現量に変化が認められれば、センサーの開発に使用する。
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| Causes of Carryover |
研究の進捗状況がやや遅れており、計画していた実験に至っていない部分があり、計画より物品の購入が少なかったため。遅れている研究を速やかに行えるよう計画を立て直し、プロモーターアッセイ作成用の物品などの購入に充てることを計画している。
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