メタゲノム解析を用いた口腔細菌における内頸動脈狭窄症に対する病原性の追求

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K17381
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 宮久保 あや子 昭和大学, 歯学部, 助教 (50643706)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 口腔細菌 / 内頚動脈狭窄症 / メタゲノム解析

Outline of Annual Research Achievements

アテローム性動脈硬化症などの病変部より口腔細菌が検出され、口腔細菌叢と動脈硬化の関連が注目されているが、明確な結論が得られていない。本研究は、内頚動脈狭窄症と口腔細菌叢との関連性を解明し、特異的口腔細菌に対した効果的な周術期口腔機能管理のプロトコールを確立することを目的とする。
本年度の研究実績は、口腔細菌と内頚動脈狭窄症の内膜に付着したプラーク及び血栓のサンプルを的確に採取した。採取した検体よりDNA抽出を行い、内頚動脈狭窄症の内膜に付着したプラーク及び血栓中に細菌が存在しているのか検討することから施行した。
その方法として全ての細菌が持つとされている16SrRNA領域プライマーを設計し、PCR（V4領域の増幅）を行い、PCR産物を電気泳動し増幅物の有無を確認した。得られた配列データの相同性検索から菌種の同定を行った。
今までで得られた症例サンプルは55例を採取した。そのうち内頚動脈狭窄症の内膜のPCR産物から11例何らかの細菌がいる可能性が示唆された。その中で6例に次世代シークエンスを行い菌種の同定を行った。口腔内と内頚動脈内膜に共通した細菌の検出が認められ、Streptococcus属、Corynebacterium 属、Actinomyces属、Neisseria属の5例を認めた。
更にReal-time PCRで菌種特異的プライマーを用いてqPCR法にて定量し、次世代シークエンスで得られた菌種と存在量の正確性を反映しているか検討した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

採取したサンプル55例中、PCR産物から何らかの細菌が存在する可能性がある検体を次世代シークエンスを用いて菌種の同定を行った。多種多様な菌種を認め、内頚動脈狭窄症と口腔細菌の相関性について考察するために、更にReal-time PCRで菌種特異的プライマーを用いてqPCR法にて定量し、次世代シークエンスで得られた菌種と存在量の正確性を反映しているか検討しているため実験に遅れがでてしまった。更に研究代表者の出産のための研究休止のため研究が一時中断となった。

Strategy for Future Research Activity

引き続き次世代シークエンスで同定して菌種とReal-time PCRで得られた菌種と存在量の正確性を反映しているか検討する。また、サンプル間で菌種の存在量を比較解析し、循環器疾患患者に共通する菌種を明らかにする。
更に、内頚動脈狭窄症に関連する口腔細菌のメカニズムを培養細胞を用いた感染実験を行い、原因菌の持つ新規病原因子の解析を行っていく。

Causes of Carryover

次世代シークエンスによる細菌同定後、研究の考察や患者の生活環境に関するメタデータの回収や解析のため費用がかからなかった。その後、産休・育休のため、研究が一時中断した。
次年度では、引き続き論文作成と研究発表のため次年度に使用することとなった。