2019 Fiscal Year Research-status Report
心筋特異的多蛍光発色マウスを用いた内因性心筋分裂促進因子の探索と治療応用
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17K17636
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
神田 真人 千葉大学, 医学部附属病院, 特任助教 (50444055)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 心筋再生 / 細胞移植治療 / 心筋梗塞 / 褐色脂肪組織 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は心筋特異的多蛍光発色マウスマウスモデル(Rainbow-Cre マウス)を用いて、MI後に褐色脂肪組織(BAT)細胞の移植療法等を行い、それらによる心筋細胞分裂促進作用を調べる。さらに、再生出現部位を特異的に採取・解析することで新規心筋再生促進因子を同定し、あらたな再生医療につなげることを目的とする。平成29年度にはRainbow-Creマウス(Rb/Cre遺伝子)のRb/Rbホモ体を作成し、心筋梗塞(MI)群でsham群に比べ、再生頻度が増加していることを確認している。平成29年度から31年度にかけては、このマウスへの細胞移植療法を確立発させた。褐色脂肪粗機(BAT)細胞を、マウスの背部、および腋窩部より採取、増殖因子の
入ったメソカルト等とともに10-14日培養し、その後いったん分離し、PuraMatrixとあわせて3次元培養を行った。MIを作成したモデルマウスを2-4週間後に再度胸腔を解放して、心筋梗塞ができていることを確認後、上記のBAT+ PuraMatrix移植群とVehicle単独移植群にわけ、移植処置を安定して行えるようになった。移植後4-8週後も細胞が残存することを確認しており、また心エコー・MRIによる評価では移植群で、コントロール群に比較して、心臓のリモデリングを抑制し、心機能を保持している傾向を確認した。この手法を上記Raibow-Creマウスに適応し、安定して心筋組織切片を得ることができた。これにより、増殖マーカーによる免疫染色では難しかった、cytokinesisまで完遂した完全な増殖部位および頻度を探知できることを確認しており、細胞移植時に増殖促進部位を特異的に捕らえる手技を確立できた。令和元年度にかけては、BAT細胞の自家移植を行うことで、同種移植よりさらに移植細胞の生着を高めることができた。同手法による移植群を今後解析予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、心筋特異的多蛍光発色マウスに心筋梗塞モデルを作成し、モデルが作成されていることを心エコー機器にて確認したのちサクリファイスするが、機器の故障により、代替の機器で評価できる様になるまで時間を要した。また、マウスの妊孕性が落ちた時期があり、実験に必要なマウスの数量の確保が難しい時期が一定期間存在した。上記の問題は、現在解決されており、令和2年度の実験施行に当たっては問題ないと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記モデルが確立したため、Rainbow-Creマウスにおける慢性期の移植治療による心筋再生の促進効果およびそのメカニズムについて検討していく。その際、令和元年度に確立した自家移植（自分のBAT由来細胞を採取して、培養、再度自分の心臓に移植するモデルと同種移植モデルでの成績を比較し、より良好なモデルを用いる。BAT細胞に分裂・増殖促進作用があることがわかったら、モデルマウスに於いて分裂・増殖部位を特異的に採取する。 まず、慢性期心不全モデルにおいてBrdU・Ki67・AuroraBなどの従来のマーカーを用いて、最も分裂が進んでいる時期を同定する。次に同定した分裂期において、発現因子している因子を比較し、心筋分裂誘導候補因子を選別する。候補因子の中からin silico、およびqRT-PCRによる絞り込みを行う。絞り込んだ因子を成体マウスから採取した培養心筋細胞に投与し、増殖促進効果について細胞増殖マーカー等により検証し、もっとも効果のあるものを同定する。さらに同定された新規因子については、in vivoでの分裂誘導効果を評価する。促進因子の増産のために、cDNAの形でプラスミドに導入したあと、大腸菌を用いて増殖・精製を行い、マウスにプラスミドの形でトランスフェクションする、もしくはベクターウイルス等を用いて導入する。M後慢性心不全期に心機能改善効果をみると同時に、心筋分裂促進作用をこれまでと同じように多蛍光発色マウスを使った評価する。
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| Causes of Carryover |
機器の故障等により、研究計画に遅れが生じたため。昨年度施行予定であった、細胞移植実験の継続および心筋再生促進因子の解析のための外部委託を本年度行う予定である。
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