2018 Fiscal Year Research-status Report
A microfluidic approach for large-scale single-exosome analysis
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17K17645
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
Kim SooHyeon 東京大学, 生産技術研究所, 講師 (80709189)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | エキソソーム / 単一細胞組み合わせ / 誘電泳動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、エキソソームを一粒子レベルで効率よく標識することを可能とするMicrofluidic Combinatorial Indexing (MCI)法を確立し、個々のエキソソーム内のmiRNAについて網羅的解析が可能な1エキソソーム解析方法の構築を目指す。
MCI法を確立するため、単一粒子を指定のマイクロウェルへ順番にトラップすることが可能なAddressable Electroactive Microwell Array (AEMA)を開発し、単一粒子の組み合わせを実現した。具体的には、各マイクロウェルの誘電泳動電極を個別に制御可能なAEMAを用いて、単一粒子を指定のマイクロウェルへ順番にトラップすることで、選択的に単一粒子の組み合わせを作ることが可能である。検証実験として、青、緑、赤色の蛍光色素で染め分けたPC 3（前立腺癌腫瘍細胞株）細胞群を、1つのマイクロウェルにそれぞれ1細胞ずつトラップすることに成功し、確実性の高い単一細胞組み合わせ方法を実現した。
一方、エキソソームの単離の検証と高感度エキソソームの定量化を実現するため、単一エキソソームELISA法を確立した。具体的には、ターゲットエキソソームに対する捕捉抗体で表面修飾したマイクロビーズを用いて、マイクロビーズ上に捕捉抗体、エキソソーム、酵素標識検出抗体の３つの複合体を形成させる。各マイクロビーズを超微小液滴に封入することで、検出抗体の酵素によって反応生成物（蛍光分子）が超微小液滴中に濃縮されるため単一エキソソームの検出が可能になる。ここで蛍光信号を発する液滴の数と、発しない液滴の数を比較することで、エキソソーム単離が検証できる。また、エキソソームを単一粒子レベルで検出することによりエキソソームの高感度定量化が可能であるため、エキソソームをターゲットにする診断デバイスの開発への応用も期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
エキソソームを一粒子レベルで標識することが可能なMCI法を実現するため、各マイクロウェルの誘電泳動電極を個別に制御可能なAEMAを研究開発した。実証実験として異なる細胞群をマイクロウェルにそれぞれ1細胞ずつトラップし、単一細胞の組み合わせを作ることに成功した。このAEMAを用いてMCI法を実現するためには、細胞と異なる電気的な特性を持っているマイクロビーズを、誘電泳動を用いてAEMAに捕捉しなければならない。マイクロビーズを捕捉するため誘電泳動バッファーの電気伝導率と印加電圧の周波数などの捕捉条件を最適化することで、マイクロビーズを誘電泳動により電極に捕捉することが可能になった。
一方、エキソソーム捕捉ビーズを用いたエキソソーム単離を検証するため、単一エキソソームELISA法を確立した。具体的には、ターゲットエキソソームに対する捕捉抗体で表面修飾されたエキソソーム捕捉ビーズにエキソソームを捕捉した後、β-galで標識された検出抗体を結合させることで、マイクロビーズ上に捕捉抗体、エキソソーム、酵素標識検出抗体の３つの複合体を形成させる。ここでマイクロビーズの個数よりターゲットエキソソームの個数が十分に少ない場合、マイクロビーズ１個につき、３つの複合体が１分子のみ結合しているか、全く結合していないかどちらかの状態になる。エキソソームを捕捉し複合体を形成したマイクロビーズに、酵素の蛍光基質を添加して懸濁液を作成し、疎水性材料で製作したマイクロウェルへ入れた後、オイルを入れることで自動的に微小液滴が形成される。これにより各マイクロビーズを油性液体でマイクロウェルに封入できる。３つの複合体を結合したマイクロビーズを含む液滴のみが蛍光を発するので、蛍光信号を発する液滴の数をカウントすればエキソソームの数が得られる。これにより単一エキソソームの定量化を実現し、ELISA法を確立した。
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| Strategy for Future Research Activity |
MCI法を用いたエキソソーム内RNA解析を実現するために、インデックス配列を含むDNAライブラリープールを生成する。まず、それぞれ別のインデックス配列を含むRNAライゲーションアダプターを表面修飾したRNA捕捉ビーズを作成する。RNA捕捉ビーズを、1つのマイクロウェルに封入し、エキソソームの破砕、アダプターライゲーションを行い、エキソソームから取り出したRNAをRNA捕捉ビーズに捕らえることで、各エキソソームからのRNAを標識する。その後、RT－PCRを行うことでインデックス配列を含むDNAライブラリープールを作成する。得られたDNAライブラリーを次世代シーケンサーにてシーケンスし、そのデータを解析することで単一エキソソーム毎に識別された核酸の網羅的な情報を得ることができる。各エキソソームことにインデックス配列で識別されているため、単一エキソソーム解析が可能になる。
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| Causes of Carryover |
インデックスビーズと、エキソソーム捕捉ビーズを一粒子レベルでトラップし、各エキソソームを標識するMCI法の開発に対して、誘電泳動を用いてマイクロビーズをトラップすることが困難であった。マイクロビーズの電気的な性質は細胞の性質と大きく異なっているため、バッファーの組成や印加電圧の周波数などのトラップ条件を最適化することで問題を解決した。しかし、予想以上に時間を所要したため、DNAライブラリープールを生成用の試薬などの購入が遅れ次年度使用額が生じた。次年度に、DNAライブラリープールを生成するための試薬など消耗品の購入に研究費を使用する予定である。
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