2018 Fiscal Year Research-status Report
特定ゲノム領域の可視化とエピゲノム操作を用いた遺伝子発現制御の動態解析
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17K17719
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
半田 哲也 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 特任助教 (40772570)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス / 遺伝子発現制御 / ヒストン修飾 / クロマチン / 生細胞イメージング / CRISPR/Cas9 / エピゲノム編集 / RNA Polymerase 2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒストンの翻訳後修飾は遺伝子発現制御に重要な役割を果たしており、細胞の形質発現制御の基盤として働いている。本研究は、従来の細胞を固定するようなスナップショット的な解析では明らかにできていない、環境応答や細胞分化の際に、生きた細胞核内でクロマチン構造がどのように変化し、遺伝子発現が制御されているのかという問題に挑む。熱ショック応答において、マスター転写因子であるHSF1が活性化し、標的遺伝子の転写を誘導する。ヒトではHSF1結合配列が、Satellite 3 (Sat3)リピート配列内にも存在し、熱ショックに応答してSat3 RNAの転写が観察される。クロマチンの運動様式と遺伝子発現の相関が報告されているが、その因果関係やヒストン修飾がどのように影響するのかは分かっていない。今年度はCRISPR/dCas9システムを応用した特定ゲノム領域の可視化技術とヒストン修飾の人為的操作(エピゲノム編集)を組み合わせ、クロマチンの運動性を測定した。Sat3リピート配列を標的とするsgRNAとともにdCas9-3xsfGFP、またはヒストンアセチル化酵素の１つであるp300の酵素活性ドメインを融合させたものを発現させ、Sat3クロマチン領域の運動性をMSCD (Mean Square Change in Distance)で評価した。その結果、p300酵素活性ドメインを融合させた場合に、クロマチンの運動性が増加していることが分かった。このことから、ヒストンのアセチル化がクロマチンの運動性を上昇させ、RNA Polymerase 2（RNAPol2）活性化因子との衝突頻度を亢進することで、転写活性化に寄与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRISPR/dCas9によるゲノム領域の可視化、およびヒストン修飾酵素・脱修飾酵素の機能付加において、蛍光タンパク質のコンストラクトを再検討したところ、3つタンデムにsfGFP（super folder GFP）を融合することで、安定発現株においても長時間での生細胞イメージングが可能になった。
リピート配列ではなく、内在性ゲノム配列での一遺伝子領域の可視化を行うためには、比較的に狭い領域に多数のsgRNA配列をデザインしなくてはならない。Streptococcus pyogenes Cas9を用いた場合にはPAM配列（NGG）の制限があるため、限定された領域しか可視化することができない。そこでPAM配列の制限をNGGからNGに緩和した改良型SpCas9NGを用いることにした。酵素活性を失活させたdCas9NGに3xsfGFPを融合させたコンストラクトを作成し、今後NGG, NGA, NGT, NGCいずれの配列でも機能するかを確認し、一遺伝子領域の可視化へと応用する。
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| Strategy for Future Research Activity |
クロマチンの運動様式と転写活性化の関係性、およびヒストン修飾の寄与を明らかにするために、熱ショック応答時の各タイムポイントでのSat3領域のMSCDを測定する。クロマチン運動性の変化に必要な要素を抽出するために、ヒストンアセチル化酵素阻害剤、アセチル化を認識するBRDの結合阻害剤、またRNAPol2活性化リン酸化酵素の各種阻害剤を添加した条件でも測定を行う。
哺乳類の雌の体細胞では、遺伝子量補正のために、2本あるX染色体のうち片方の転写が不活性化されている。分化過程で、片方のX染色体から非コードRNAであるXistが発現し、そのX染色体全体を覆い、H3K27トリメチル化など、ヒストン修飾を介して、高度に凝集したゲノム3次元構造をとるようになる。この不活性X染色体形成過程における、Xsit RNAの挙動、ヒストン修飾やクロマチン構造がどのように変化していくのかについて理解するために、効率の良い内在性Xist RNAの可視化系を構築する。RNAをターゲットとするclass 2 type VI CRISPR/Cas13システムの比較解析を参考し、Ruminococcus flavefaciens由来のCas13（CasRX）を用いる。マウスES細胞の分化誘導時に、Xistの発現とヒストン修飾の変化を生細胞イメージングを組み合わせて解析する。
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| Causes of Carryover |
生細胞イメージング可能な安定発現細胞株の作成に時間を要したため、ヒストン修飾の変化を観察するための蛍光標識プローブなどの消費が少なかった。次年度は、今年度に作成した細胞株を用いて、様々な条件下で生細胞イメージングを繰り返すため、細胞培養に関わる試薬、抗体精製、プローブ作成のためのカラムや蛍光色素などの消費が大幅に増加すると考えられる。
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[Journal Article] Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging2019
Author(s)
Kazuo Yamagata, Kouhei Nagai, Hiroshi Miyamoto, ...., Tetsuya Handa (17番目), Hiroshi Kimura, Yoshihiko Hosoi, Tasuku Mitani, Kazuya Matsumoto, Akira Iritani
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 9 巻
Pages: 4050
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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