2017 Fiscal Year Research-status Report
胃癌抑制分子αGlcNAcを生合成する糖転移酵素α４GnTの発現制御機構の解明
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17K17779
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| Research Institution | Shinshu University |
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Principal Investigator |
小村 仁美 信州大学, 医学系研究科, 特任助教 (30616032)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | αGlcNAc / 糖鎖 / α4GnT / 糖転移酵素 / 発癌 / 分化型胃癌 / 遺伝子発現 / MUC6 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
胃の腺粘膜液には、ピロリ菌から胃粘膜を防御しているN-アセチルグルコサミン（alphaGlcNAc）を有する糖鎖O-グリカンが存在するが、当研究室で、O-グリカン生合成を担うヒトalpha1,4-N-アセチルグルコサミン（alpha4GnT）を単離した。A4gntノックアウトマウスの胃粘膜液と十二指腸粘膜ではalphaGlcNAcが消失しており、alpha4GnTはalphaGlcNAcの生合成に関わる唯一の糖転移酵素であることが分かった。全てのA4gntノックアウトマウスは、ピロリ菌非存在下で胃の幽門部に分化型腺癌が発生するが、alphaGlcNAcは、ヒトでも分化型腺癌の発生を抑制しているため、マウスでのalpha4GnTの発現や、その関連分子との相互作用を調べることは、マウスのみならず、ヒトでも同様のメカニズムで分化型腺癌が制御されると考えられ、重要である。
A4gntノックアウトマウスの胃の幽門粘膜では、ピロリ菌非感染でも、5週齢で過形成が観察され、このような早い週齢から野生型との差が見られることから、alpha4GnT発現は胎児期に始まっていると考えられた。しかしながら、alpha4GnTがマウス発生段階のどの時期から発現しているかは、いまだ明らかになっていない。胎児胃でのalpha4GnT発現と合わせて、alphaGlcNAcが結合するムコチンコアタンパク質MUC6や、胃で発現するもう1種類のムコチンコアタンパク質MUC5AC、また、MUC6やMUC5ACと結合し、癌との関連が報告されているTFF（Trefoil factor family）2やTFF1に関しても、リアルタイムPCR法により発現量を測定し、発現開始時期を明らかにした。同時に、胎児胃の凍結切片も作製し、HIK1083抗体によるalphaGlcNAcの染色も行い、局在開始時期も調べた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
胃癌抑制因子alphaGlcNAcの生合成に関与する唯一の糖転移酵素alpha4GnTの発現開始時期は、いまだ明らかになっていない。A4gntノックアウトマウスは、5週齢から胃の過形成が観察されるため、野生型マウスでは、この時期以前からalpha4GnTが発現すると考えられた。よって、マウス胎児の胃原器が形成されるE（embryonic day）11から出生前のE19までの胎児の胃を用いてalpha4GnTの遺伝子発現とalphaGlcNAcの局在を確かめた。
まずは最初に、膣スメア染色から判断した適切な性周期の雌マウスを雄マウスと掛け合わせた後に、プラグ確認と膣スメアチェックで妊娠マウスを確定し、お腹の膨らんでいない状態でも雌マウスが妊娠しているか否かを判断出来るようにした。合わせて、蛍光免疫組織染色法を行うにあたり、使用抗体の固定条件および染色条件の検討も行った。
実験条件を確定した後に、野生型マウス胎児胃から抽出したRNAを逆転写してcDNAを作製し、TaqManリアルタイムPCR法によって、alpha4GnT発現レベルを定量的に測定、比較した。この結果、alpha4GnT発現はE13.5から始まり、E19.5にかけてその発現量は急激に増加することが明らかになった。また、MUC6、TFF1、TFF2ではE15.5から発現上昇が見られ、発現量は急激に増加していった。
同時にE11.5からE19.5までのそれぞれの胎児胃の凍結切片を作製し、HIK1083抗体によるalphaGlcNAcの染色も行い、E15.5から胎児の腺粘液細胞と思われる部位に強い局在が見られた。alpha4GnT発現が見られたE13.5より後でalphaGlcNAcの局在も見られ、alpha4GnTがalphaGlcNAcを生合成する唯一の糖転移酵素ということから考えても妥当な結果である。
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| Strategy for Future Research Activity |
野生型マウス胎児胃発生におけるalpha4GnTおよび関連分子の発現の経時変化の関係をTaqManリアルタイムPCR法により明らかにした。alpha4GnTはE13.5でその遺伝子発現を開始し、MUC6、TFF1、TFF2はE15.5から発現し始め、その発現量は発生が進むに従って著しく増加した。また、蛍光免疫組織染色法により、alphaGlcNAcの胎児胃の腺粘液細胞における局在はE15.5から始まることを確認した。この時期でのalpha4GnT発現上昇が、胃癌発症の抑制に影響を及ぼすことが考えられる。これらは、全てが野生型マウスで得られた結果であるが、A4gntノックアウトマウスで同様の実験を行った場合、alpha4GnTに関連する各種遺伝子の発現開始のタイミングや発現レベルに、野生型マウスと比較してどのような違いが見られるのかを確かめる。このことは、胃での分化型腺癌発症に対するalpha4GnT影響を見る上で重要であると考えられる。また、A4gntノックアウトマウスでMUC6、MUC5AC、TFF1、TFF2の発現パターンに変化が見られた場合、これら分子の転写因子の発現やその局在に影響するのかも、TaqManリアルタイムPCR法および蛍光免疫組織染色法により調べたいと考えている。
粘膜の中層から深層にかけて存在するする副細胞、幽門腺細胞、噴門線細胞からなる腺粘液細胞から分泌される腺粘液の中にMUC6と結合したalphaGlcNAcは存在するが、蛍光免疫組織染色法により、これらの細胞のマーカー分子に対する特異抗体を用いて共局在を調べ、発生段階で変化するのかを明らかにしたい。
また、MUC6と結合することが知られているTFF2と、alphaGlcNAcの共局在が野生型マウス発生段階において変化するかどうかも、蛍光免疫組織染色法により詳細に調べる予定である。
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| Causes of Carryover |
平成29年度の研究で次年度使用額が生じた理由であるが、当初平成29年度に予定していたA4gnt遺伝子プロモーターを活性化する転写因子の同定や、胃特異的なヒストン修飾によるalpha4GnT遺伝子の制御に関する実験を取りやめ、平成30年度以降に予定していた、野生型マウスの胎児期の発生段階におけるalpha4GnTの発現を確認する実験を先に行ったため、取りやめた実験に使用予定であった実験キット、放射性同位体、各種阻害剤等の購入は行わなかったことによる。
また、RNA抽出キットや各種酵素および試薬類、プラスチック製品等は研究室ですでにまとめ買いしていたものを使用することが出来たため、平成29年度に関して、これら消耗品の購入額はそれ程高くはなかった。また、年度途中の2か月間程、研究代表者の病欠期間があったため、その分の研究の進行は遅れており、研究を進めて行く上で必要に応じて研究費を執行していたため、当初の見込み額よりも執行額が低くなっている。
次年度使用の計画に関しはであるが、蛍光免疫染色で使用する特異抗体で所属研究室にないものを複数購入予定であることと、TaqManプローブを新たに複数購入予定である。また、RNA抽出キットや各種酵素、プラスチック用品等の消耗品等の購入も検討している。また、研究内容を論文で発表したいと考えているので、英文校閲費や投稿費用に充てたいと考えている。
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| Remarks |
信州大学医学部医学科・大学院総合医理工学研究科医学系専攻医学分野 分子病理学教室ホームページ
http://www.shinshu-u.ac.jp/faculty/medicine/chair/i-2byori/index.html
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