2017 Fiscal Year Research-status Report
線毛運動障害による髄液ダイナミクス異常とダイニンの分子生物学的解析
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17K17792
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
竹内 和人 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (90710088)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 水頭症 / 髄液ダイナミクス / 線毛 / ダイニン / Dpcd / Lrrc6 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
先天性水頭症の発症メカニズムを解明するべく、脳室上衣細胞の繊毛運動により引き起こされる髄液循環動態の解明を試みた。先天的に繊毛運動異常を持ち水頭症を発症するLrrc6ノックアウトマウス、Dpcdノックアウトマウスを利用し、脳室拡大の様相、また髄液琉、繊毛運動を観察しWild typeマウスとの比較検討、ダイニン分子の発現について主座を置き検討を行った。本年度の目標として髄液のマクロ、ミクロレベルでのダイナミクス解析が施行された。
1.繊毛運動障害マウスにおける水頭症発現、脳室拡大様式の経時的な観察並びに生体内でのマクロ的髄液還流の計測：ノックアウトマウスにおける水頭症発現様式の検討をMRI撮影を経時的に行うことで施行した。両ノックアウトマウスはP0-1では脳室拡大を認めないものの、P2より徐々に脳室の拡大が認められた。拡大は側脳室が中心であり、第三脳室の拡大は乏しく、第四脳室および脳溝の拡大はP28においても認められなかった。出生時に存在する一次線毛は髄液ダイナミクス形成に影響を与えず、出生後形成される運動線毛により髄液流が形成されることが確認された。また中脳水道以遠の脳室拡大はほとんどなく、この上位での髄液流形成異常が水頭症の主要因であると考えられた。
2.マウス脳室線毛の運動局在並びにミクロ的髄液還流形成についての検討：wild typeにおいては側脳室～第三脳室、第四脳室に向けての主な髄液流の形成が認められたが、各脳室内では円を描くように髄液流が形成されていることが判明した。水頭症マウスにおいてもこの髄液流の形成が確認され、各々の髄液流に強弱が認められた。これは発言するダイニン蛋白の局在に違いが見られることを意味すると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究は概ね順調に推移している。しかし髄液流ならびに線毛運動観察には十分なサイズの脳組織が必要であり、出生早期に死亡するLrrcではこの観察が非常に困難であった。またcineMRIはラットでの報告はあるものの、使用予定であったMRIでの撮像は困難であり生体内のマクロ的髄液の確認は不可能であり更なる検討が必要と判明した。また、これまでの研究で判明したダイニンの分布についても検討が必要であることが判明したため、来年度の追加課題として検討を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究は概ね順調に推移している状態である。本年度は当初予定していた分子メカニズム解析を目標とする。具体的にはDpcd ノックアウトマウスでは約半数の線毛が運動障害を起こすが、上衣細胞内のダイニンmRNA量を定量PCR法を用いて測定することで、線毛内でのダイニン発現量を測定する。Dpcdが直接ダイニンプロモーターに結合し、制御しているのか、クロマチン免疫沈降法（ChIP法）を用いて解析する。Dpcdがプロモーターに結合していなければ、マイクロアレイ法にて、他の転写因子を検索する。また、Lrrc 6ノックアウトマウスではダイニンの線毛への輸送異常が誘導されると考えられているが、その制御メカニズム異常は知られていない。このため正常マウスの上衣細胞からタンパク質を抽出し、Lrrc6とダイニンが結合し複合体を形成するかどうか、免疫沈降法にて検討する。また高効率遺伝子導入用レトロウイルスベクターであるpDON-AI-2 DNAを使用して、Dpcd、Lrrc6に対するshRNAを発現するベクターを作成する。レトロウイルスを正常マウスの脳室内に打ち込み感染させ、ダイニンの発現、細胞内局在の変化、線毛異常の発現、水頭症の発症を検討する。
前述の通り線毛運動には局在が強く認められており、これは特にノックアウトマウスに於いて強い傾向にあった。これはダイニン蛋白サブタイプの分布に脳室内であっても局在があると予想されるため、本年度は上記に加えて発現ダイニンの解析も行う予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度は当初使用予定であった試薬購入は共同研究者からの提供を受けたこともあり支出を抑えることが可能であった。また研究成果が充分でないため学会発表等も少なく、旅費等での支出が少なかった。次年度は試薬提供がなくなるため当初予定の支出が必要となると考えられる。また、成果報告目的の旅費費用が十分量必要となることが予想される。これに加え、本年度の研究課題に追加すべき事項が認められたため本年度の余剰資金を持ってこの研究に当てる予定である。
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