Development of extended Target-AID for deaminase-mediated prokaryotic genome editing

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K17879
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 坂野 聡美 大阪大学, 情報科学研究科, 特別研究員(PD) (00513160)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 大腸菌 / 遺伝子工学 / ゲノム編集

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、DNA を切らずにゲノム編集を行うことのできるTarget-AID の技術を原核生物に応用・最適化することで、バクテリアDNA を切ることなく高効率に、かつ簡便 なゲノム編集を実現することを目指した。まずは大腸菌において、Target-AIDの基本技術の構築を行った。
＜変異導入の条件検討等＞ rifampicin耐性以外のスクリーニング法を確立するために、標的遺伝子としてpyrD, pyrE, pyrF (5-FOA耐性), thiA (trimethoprim 耐性) を選定し、塩基置換実験を行った。スクリーニングに最適であろう遺伝子の部位が同定され、塩基置換効率をモニターする系としてこれらを利用できる可能性が示唆された。
＜Target-AID による複数遺伝子同時変異導入＞ これまでの実験より、uracil DNA glycosylase inhibitor (UGI) を用いた機能向上Target-AID を用いた場合、異種6遺伝子の標的部位への同時変異導入が可能となった。しかしその一方で、標的以外の部位にも変異が導入されてしまうoff-target の確率が上昇してしまうという欠点があげられた。このゲノム編集ツールの正確性をさらに向上させるために、deaminase 結合部位のリンカーの長さを変化させたときの塩基置換効率を、rifampicin 耐性によるプレートスクリーニングを用いて調べたが、特に大きく効率が良くなるものは同定できなかった。
＜ゲノム編集ツールの汎用性拡大＞大腸菌の菌株の違いに対する、遺伝子への変異導入効率を検証した。5種類の菌株を用い、rpoB, galK を標的とした変異導入を行った結果、同一の標的でも菌株の違いにより変異導入される割合、また変異の入る部位がそれぞれ異なることが明らかとなった。特に今回の条件においては、野生株MG1655株は非常に変異導入されにくかった一方で、同じく野生株W3110株は変異が入りやすかった。今後さらなる追加検証が必要である。