2018 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of novel aging-related regulators of ovarian follicular reserve
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17K17918
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
諌山 慧士朗 山口大学, 大学研究推進機構, 助教 (30780887)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 卵巣老化 / GONAD法 / ゲノム編集 / 次世代シーケンス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平均寿命が延びる一方で、卵巣寿命（閉経年齢）は延びていない。卵巣寿命を延長、もしくは老化進行を緩和することができれば、健康寿命の増進、晩婚化、また少子高齢化対策に貢献すると考えられる。卵巣においては、老化に伴う卵胞の貯蔵数減少、発育不全、また排卵刺激応答の低下が認められるが、これら卵巣機能低下の要因は多様であり、分子メカニズムについて不明な点が多い。本研究では、次世代シーケンス（Super SAGE法）を用いてマウス卵巣の遺伝子発現を網羅的に調べ、加齢により顕著に発現変化する遺伝子群を抽出し、その卵巣機能低下への関与を明らかにすることを目的とした。
平成30年度は、CRISPR-CAS9を用いたゲノム編集個体作製技術である直接卵管導入法（GONAD法）を習得した。実際にGONAD法を用いて、次世代シーケンサーにより抽出した老化関連分子であるアルドケト還元酵素遺伝子のノックアウトマウス作製を行った。GONAD法を処置した妊娠マウスより、合計で51匹の新生仔が得られた。遺伝子型の内訳はホモ変異7匹、ヘテロ変異12匹、モザイク変異13匹、または野生型19匹であった。現在、変異個体の中でナンセンス変異によるノックアウトが予測される3系統を選択・飼育している。今後、これらの系統における排卵・妊娠における表現型を解析し、標的遺伝子の卵巣老化における機能を理解する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H29年度までは、次世代シーケンサーによる網羅的解析から老化関連分子として着目したアルドケト還元酵素の加齢に伴うmRNA量、発現局在、酵素活性の変化について明らかにした。H30年度では、標的遺伝子の卵巣機能を明らかにするために、卵巣組織培養におけるRNA干渉を検討していたが、予備実験の段階でアデノ随伴ウイルスベクターの十分な濃度が得られず時間を要した。一方、ゲノム編集によるノックアウト個体作製を進め、系が確立したので、そちらに力を入れた。アルドケト還元酵素のノックアウト個体を作製し、計画通り卵巣における機能解析を行う段階まで進んだ。
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| Strategy for Future Research Activity |
標的遺伝子の卵巣機能を明らかにするという目的は、RNA干渉解析とノックアウト個体解析とで同様であるので、最終年度は成功している後者の解析を集中して行う。着目したアルドケト還元酵素遺伝子の解析結果から観察すべき点を見出しており、ノックアウト個体における表現型解析を主体に進めいていく。
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| Causes of Carryover |
卵巣培養組織におけるRNA干渉実験で用いるアデノ随伴ウイルスベクター作製が遅れる一方で、ゲノム編集によるノックアウト個体作製が進んだ。このため研究計画を見直す必要があり、着目遺伝子の機能を明らかにするという目的達成のためにノックアウト解析に集中することにした。したがってRNA干渉実験を止めた分、未使用額が生じた。この未使用額は、次年度のノックアウト解析に用いる試薬の購入費と併せて使用する。
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