2018 Fiscal Year Annual Research Report
Screening of aldoxime dehydratase with broad substrate specificity for nitrile synthesishesis
| Project/Area Number |
17K17996
|
|---|
| Research Institution | Toyama Prefectural University |
|---|
Principal Investigator |
松井 大亮 富山県立大学, 工学部, 助教 (40748513)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | アルドキシム脱水酵素 / アルドキシムーニトリル経路 / ニトリラーゼ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
1. 異なる生物種からアルドキシム脱水酵素（Oxd）を取得することを目的として、様々な環境（海洋深層水など）から取得したサンプルからメタゲノムを抽出し、昨年度確立したスクリーニング条件でのOxd活性を有する酵素遺伝子の取得を検討した。既存のOxdに高い相同性を示す配列を取得することはできたが、高い新規性の酵素遺伝子の取得には至らなかった。
2. 既知酵素に変異を導入し、基質特異性を改変するため、2,2-ジフェニルアセトアルドキシムなどの嵩高い基質を合成し、BacillusおよびFlavobacterium由来のアルドキシム脱水酵素の変異ライブラリーを用いてスクリーニングを行った。基質ポケット内の一部残基に変異が入ることで、Oxd活性が1.5倍程度上昇したが、活性が飛躍的に上昇した変異型酵素の取得には至らなかった。
3. 自然界からのスクリーニング（上記1）や基質特異性の改変（上記2）だけでない、その他の機能改変に本スクリーニングが利用できると考え、熱安定性が低いFravobacterium由来Oxdの変異型酵素（OxdFG）のスクリーニングを実施した。大腸菌XL-1Redを用いてOxdFGのランダム変異ライブラリーを調製し、本スクリーニング条件で変異酵素を探索した結果、複数の安定性が上昇した変異型酵素を取得することができた。変異部位を明らかにした結果、同一の部分に変異が入っていることが明らかとなった。本酵素を精製後、野生型酵素と諸性質を比較した結果、基質特異性などには影響はなく、約10度の熱安定性が上昇していることが明らかとなった。さらに、本変異型酵素の結晶構造解析のための結晶化スクリーニングを行った。
|
