2019 Fiscal Year Research-status Report
環境中の細菌捕食性原生生物群集の増殖特性定量法の開発と実証
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17K18000
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
片岡 剛文 福井県立大学, 海洋生物資源学部, 准教授 (10533482)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 水圏生態系 / 原生生物 / 原核生物 / 摂餌量 / 無菌培養 / 単離株 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
水圏生態系の微生物ループにおいて細菌捕食性原生生物が原核生物を摂餌することで輸送される有機物量を見積もるために、新しい手法開発と現場環境での実証を行うのが本研究の目的である。現場環境に即した見積もりを導出するためには原生生物と餌となる細菌の二者培養による実験系を構築し、餌となる細菌から原生生物へ輸送される炭素量を計測する必要がある。2019年度は、2018年度に海水湖から単離培養した3種類の細菌捕食性原生生物（Bicosoecida科, Vannella属, Neobodo属）を用いて、異なる直径の粒子に対する捕食速度を比較したところ、粒子直径が0.5-1.0マイクロメートルのポリスチレンビーズをよく捕食した。この結果を踏まえて、若狭湾から単離した細菌株のうち細胞直径が1.0-3.0マイクロメートルの細菌株との二者培養の構築を試みた。まず、原生生物の培養液に含まれる細菌群集を除去したのちに単離した細菌株を添加するため、原生生物株の抗生物質（抗生物質ミックス）に対する耐性を試験した。その結果、3種類の原生生物株の内、Vannella属のみが抗生物質を添加した後も増殖することが確認できた。また、餌となる細菌株10株では、対数増殖期に抗生物質を添加し濁度により増殖を計測たところ、全ての株で添加後3時間以内に増殖が阻害された。つまり、抗生物質を用いて混在する細菌を排除する場合は、餌となる細菌を3時間程度毎に与える必要があることがわかった。そこで、セルソーターを用いてVannella属の細胞のみを分取し、10種類の細菌株それぞれとの二者培養を作成して増殖の経過を観察した。10日後に植え継ぎ、30日間培養したところ5株の細菌株で増殖が確認できた。これらから、抗生物質耐性をもつ原生生物と細菌の二者培養を作成可能な手法が確立できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定では、まず、環境中から細菌捕食性原生生物と餌となる細菌単離株を単離培養し、実験条件下でそれら増殖生理を明らかにする計画であった。その後、餌となる細菌に核酸前駆体であるBrdUを添加してその取り込み量を明らかにすることでBrdU標識細菌株を作成し、それを餌として原生生物に摂餌させて細胞内に蓄積したBrdU量を計測する事で細菌から原生生物への炭素輸送量を見積もる計画であった。しかし、細菌捕食性原生生物の培養液に混在する雑多な細菌群集と単離した原生生物を分離することが困難であり、両者の二者培養を確立するのに時間を要した。抗生物質の添加量や濃度を繰り返し調整したが二者培養は成功しなかったが、複数の原生生物単離株の中からようやく１種類の抗生物質耐性を持つ原生生物を選出することができた。本株を用いることで、抗生物質を添加したのちにセルソーターを用いて原生生物細胞を分取する手法を確立することができ、増殖活性の計測に必要な実験材料（二者培養系）は揃いつつある。一方で、初年度に予定していた「生物生産の高い自然環境における細菌捕食性原生生物の網羅的解析」を若狭湾で実施し環境中の原生生物に関するデータは分析中であり、一部は結果をまとめ始めている。同一海域の天然海水にBrdUを添加して環境温度で培養した試料を保存しているので、これらを分析・比較することで自然環境中でBrdUを取り込む原生生物を特定することができる。以上より、当初の計画と比較してやや遅れていると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、2018年度に若狭湾で採集したBrdU添加後に環境温度で一定時間培養した試料を分析する。また、他の原生生物株について細菌株との二者培養系の作成を実施して複数の二者培養系を作成する。ここでは、細菌由来のrRNA遺伝子領域を特異的に検出するPCRと塩基配列分析により、原生生物株と細菌株の二者培養系であること厳密に確認する方針である。作成した二者培養を用いて原生生物の増殖速度を計測する。培養液にBrdUを添加して細菌株を培養することで細菌株のDNAをBrdUで標識し、細胞密度と群集内のBrdU量から、細菌株1細胞あたりのBrdU量を求めることでBrdU標識された餌細菌株を作成する。BrdU標識された細菌株を餌として原生生物を一定時間培養し、原生生物中のBrdU量を培養前後で比較する。培養期間中に増殖した細胞に相当する細胞数あたりのBrdU量を算出することで、細菌由来の核酸物質が原生生物へ移行するかを見積もることができる。これらをもとに、細菌から原生生物へ輸送される炭素量を導出する。
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| Causes of Carryover |
学内運営業務と学会運営業務が重なり、当研究に対するエフォートが著しく減少し実験が滞ったため消耗品費の支出が減った。また、英語論文校閲料ならびに投稿料を使用しなかったので、次年度使用額が生じた。当該助成金は単離培養した原生生物および原核生物の生理生態実験 のために次年度に使用する計画である。
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