2017 Fiscal Year Research-status Report
Identification and physiological functions of non-canonical D-amino acid synthetic enzymes in bacteria
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17K18082
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
宮本 哲也 北里大学, 薬学部, 助教 (10739238)
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2017-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | D-アミノ酸 / アミノ酸ラセマーゼ / シスタチオニンβ-リアーゼ / セリンデヒドラターゼ / 大腸菌 / 枯草菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌において、ペプチドグリカンに通常含まれるD-アラニンやD-グルタミン酸以外のD-アミノ酸 (非標準的D-アミノ酸) がペプチドグリカンのリモデリングやバイオフィルムの形成抑制や解体に関与していることが明らかとなっており、細菌は非標準的D-アミノ酸を変化する環境に対応し、生存するための環境適応因子として利用していると考えられている。しかし、これら非標準的D-アミノ酸の生合成経路については、ほとんど明らかとなっていない。本研究の目的は、細菌の非標準的D-アミノ酸の生合成経路および生理的作用を明らかにすることである。
本年度は、大腸菌および枯草菌における非標準的D-アミノ酸合成能を有する酵素の探索および同定を行った。大腸菌と枯草菌において、以前より同定していた非標準的D-アミノ酸合成能を有する2つの酵素 (YgeA、RacX) については、詳細な酵素学的解析の結果などを論文として発表した。さらに、大腸菌の有する2つのシスタチオニンβ-リアーゼ (MetC、MalY) について、各遺伝子をクローニングし、大腸菌によるタンパク質の高発現、精製を行い、組み換体酵素を取得した。精製酵素を用いたアッセイにより、2つの酵素は幅広いアミノ酸に対してラセマーゼ活性を有すること、つまり非標準的D-アミノ酸合成能を有することを明らかにした。また、D-およびL-セリンに対するデヒドラターゼ活性を有していることを新たに発見した。そこで、各反応における詳細な酵素学的解析を行い、MetCのアラニンラセマーゼ活性、システインリアーゼ活性、セリンデヒドラターゼ活性が同程度の強さであることを明らかとした。したがって、シスタチオニンβ-リアーゼは、異なる3つの活性を有する多機能酵素であり、非標準的D-アミノ酸の生合成およびセリン代謝にも関与している可能性があることが示唆された。本内容については、論文を発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は計画通り、細菌における非標準的D-アミノ酸合成能を有する酵素の同定および解析を行った。大腸菌および枯草菌において、すでに非標準的D-アミノ酸合成酵素 (YgeA、RacX) をそれぞれ同定しているが、これ以外にも非標準的D-アミノ酸合成能を有する酵素が存在している可能性があった。そこで、大腸菌の2つのシスタチオニンβ-リアーゼに注目し、組み換体酵素を精製し、種々のアミノ酸に対するラセマーゼ活性を検証した。その結果、非標準的D-アミノ酸合成能を有することを明らかにし、至適pH、至適温度、各基質における酵素の動力学定数を決定した。また、L-システインリアーゼ活性、D-およびL-セリンデヒドラターゼ活性についても解析を行い、シスタチオニンβ-リアーゼがL-メチオニン合成に関与するだけでなく、非標準的D-アミノ酸の合成やセリン代謝に関与していることを見出した。したがって、大腸菌由来YgeAおよび枯草菌由来RacX以外に非標準的D-アミノ酸合成能を有する酵素を新たに同定することができたため、本研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通り、大腸菌において同定した非標準的D-アミノ酸合成酵素の生理的役割の解明を目指す。具体的には、大腸菌細胞内のD-アミノ酸の解析、対象とする各遺伝子の発現解析、非標準的D-アミノ酸合成酵素欠損株の表現系（生育、バイオフィルム形成能、浸透圧に対する抵抗性）の解析を行う。
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