2018 Fiscal Year Research-status Report
定温増幅法および化学発光法を用いたPOCT技術によるmiRNA分析への挑戦
| Project/Area Number |
17K18112
|
|---|
| Research Institution | Showa University |
|---|
Principal Investigator |
唐沢 浩二 昭和大学, 薬学部, 講師 (90595951)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | miRNA / NASBA / ピロリン酸 / PPDK / イソルミノール化学発光 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
NASBA法
昨年度、ターゲットとするmiR-196aの増幅が可能となったことから、POCT技術へ応用するために増幅時間とTemplateの検出限界の検討を行った。その結果、マイクロチップ電気泳動でSYBR Goldの蛍光色素を用いた検出系では、100 ngのmiRNAを10分間で増幅可能となり、また、検出限界の検討では90分の反応で10 pgまで可能となった。10分で増幅が可能となったことより、化学発光法と組み合わせることでPOCT技術への応用の可能性が見いだされた。現在は安定的に増幅可能な30～60分の増幅で今後の検討を進めている。
イソルミノール化学発光法
昨年度、GAPDH酵素系でピロリン酸を検出できなかったことより、ピルビン酸オキシダーゼ系およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ系で検討を進めた。はじめにピロリン酸に0.125 mmol/L AMPと0.4 mmol/L PEPを加えて30 U/mL Pyruvate Phosphate Dikinase (PPDK) によりピルビン酸に変換し（2分）、3 mmol/L TPPと25 mmol/L NADを加えてピルビン酸デヒドロゲナーゼにより過酸化水素への反応を試みた。その結果、0.001～1.0 mmol/Lの検量線を作成（CV値(n=4)：2.3-3.8%）することができ、検出限界は5.0×10^-11 mol/assay (Blank+3SD)であった。なお、この系でのピルビン酸の検出限界は5.0×10^-11 mol/assay、過酸化水素の検出限界は5.0×10^-12 mol/assayであった。今後は本法をNASBA増幅産物へ応用する予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NASBA法によりmiRNAの増幅が可能となり、さらにPOCTに最適な時間短縮も可能であった。今回は30～60分の増幅でPOCT応用を行っている。
化学発光法では、昨年度GAPDH系で反応が進まなかったことより、PPDKと反応後のピルビン酸はピルビン酸デヒドロゲナーゼ系で反応を進めることができた。よって、ターゲットとしているピロリン酸の検出の可能になったことからおおむね順調に研究は進んでいると考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
定温増幅法であるNASBA法とイソルミノール化学発光法を組み合わせたmiRNAの検出系の確立を行う。
つまり、昨年度まで増幅と発光検出を別々の系で行っていたが、今後は増幅と検出を組み合わせてmiRNAの測定を行う。また、既存の化学発光検出器をPOCT用に改良することで、増幅から発光検出までの一連の流れを小型増幅発光装置としてmiRNAの簡易分析法の確立を行う。
ひとつのチューブ上で、NASBA反応、PPDKによる反応、ピルビン酸デヒドロゲナーゼによる反応、イソルミノール化学発光による検出を同時に行い、本測定系の完了を試みる予定である。
|
| Causes of Carryover |
NASBA反応系の研究の進行が順調に行ったことから、緩衝液や酵素の試薬が減少した影響で若干の残金が生じた。次年度、POCT系を確立するための試薬として使用する予定である。
|
