Integration of an analytical system for point-of-care test of miRNA by combination of NASBA and chemiluminescence

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17K18112
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 唐沢 浩二 昭和大学, 薬学部, 講師 (90595951)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: miRNA / NASBA / ピロリン酸 / PPDK / イソルミノール化学発光

Outline of Annual Research Achievements

POCT用小型増幅発光装置への改良
miRNAの増幅からピロリン酸の発光検出までの一連の流れを一つの小型機器で行うために、既存の発光装置を改良した。本装置により過酸化水素の検量線を作成した。その結果、5.0×10^-11 mol/assay～5.0×10^-8 mol/assay の範囲で検量線が作成できた。
NASBA法
100 ng/μL miRNAに、RNase free water、NASBA reaction mix(NTPs, dNTPs, tris buffer)、500 nmol/L T7-RT primer、500 nmol/L stem loop primer、0.1 mmol/L NASBA forward primer、0.1mmol/L NASBA reverse primer、RNase Inhibitor、NASBA Emzyme mixture (AMV RT, RNase H, T7 RNA polymerase)を混合して41℃60分反応させたものをpositive sampleとした。negative sampleは、miRNAのかわりにRNase free waterを用いた。
イソルミノール化学発光法
positive sampleおよびnegative sampleそれぞれに、AMP、PEP、DTT、EDTA、BES、Apyrase、MgCl2、Treharose、リン酸カリウムbufferの等量混合液とPPDK 溶液を加えて混和し、2分間反応させた後、ピルビン酸測定試薬（NAD、TPP、Triton X 100、MgCl2、CoA、PMS、BSA、L-Carnitine、PDH、リン酸カリウムbuffer）とPDHを添加し、37℃で30分反応させる。反応後、発光試薬100μLを加え発光強度を測定した結果、miRNAの検出が可能となった。